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1、简单实验步骤如下：1 -漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度PBS 2小时.220度甲醇固定20分钟后，自然.干燥10分钟3. PBS 洗净：3min*34 l%Triton： 25min-S0min.配成 50ultriton+5mlpBS5. PBS 洗净:2*5min6羊血清封闭：3 7度，2。分钟7抗，4度过夜，一般要大于18小时或者3 7度1一2小时8 - 4 度 PBS 洗净，3min* 5 次9二抗3 7度小于一小时10.37 度 PBS 洗净，3 * 5 min凉干封片（封闭液PH85）活细胞免疫荧光技术一流式细胞仪标本的制备（-）制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核
2、细胞、胸腺细胞.脾细胞等均可用于本法）I用10%FCS RPMI1640调细胞浓度为5X106 1 X10 7 /nlI取40 U 1细胞悬液加入预先有特异性Me Ab （550 U 1）的小玻璃管或塑料离心管，再加50 u 1 1：20 （用DPBS稀释）灭活正常兔血清I 4C 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2“左右1000rpmX5minI弃上清，加入50 U1工作浓度的羊抗讯（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇I 49 SOmin用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpmX5minI加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入11固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度
3、加入100500 U 1固定液）IFCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存57天）（二）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。2. 荧光标记的羊抗讯或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。3. 10% FCS RPMI1640, DPBS .洗涤液、固定液（见附录）。4 -玻璃管、塑料管、离心机.荧光显微镜等-（三）注意事项1. 整个操作在49下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂绘高10倍的NaN 3 ,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗 原 后发生交联、脱落.2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受
4、体，降低和防止非特异性染色。4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色.附：L DPBS （X10,贮存液）NaCl 80gKC1 2g蒸馆水加至1000mlNa2HP04 11. 5g临用时用蒸馅水1 : 10稀释KH2P0 4 2g2-洗涤液DPBS900mlFCS 50ml （终浓度 5%）4%NaN3?50nl （终浓度 0.2%）3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g （终浓度2%）甲醛10mlNaN 30. 2g （终浓度 0. 02%）我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1 取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里.PBS洗三遍。注意：有的时候作的细胞
5、爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另 外洗的时候加PBS不更太冲，不要细胞冲下来.洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟.2.4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍30.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍.5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍.6二抗室温2小时（避光人或者37度1半小时，？8，洗三遍。7最好用DAPI染核，然后宜接照荧光片.8蒸馆水洗掉PBS,甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不树脂那
6、样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊 涂。 建议：1 还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间， 荧光会袒灭的。2荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子-3二抗用之前一定离心， 不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，宜接与相应抗原反应其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是 敏感性偏低；而且每检查一种抗原就祷要制备一种荧光抗体此法常用于细菌.病毒等微生物的快速检查和肾炎活检.皮肤活检 的免疫病
7、理检查.试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS） : 0. 01mol/L, pH74 荧光标记的抗体溶液：以0. Olmol/L, pH74的PBS进行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH92 0. 2M碳酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有0. Olmol/L, pH74的PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37C温箱等实验步骤1. 滴加0. 01mol/L, pH74的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盘标本，置于有孟搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30mi
8、n） 03. 取出玻片，置玻片架上，先用0. 01mol/L pH74的PBS冲洗后，再按顺序过001mol/L, pH74的PBS三缸浸 泡，每缸3-5 min#不时振荡。4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分.但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（土）极弱的可疑荧光；（+ ）荧光较弱，但清楚可见；（+十）荧光明亮；（廿+f廿）荧光闪亮。待检 标本特异性荧光染色强度达“廿”以上.而各种对照显示为（土）或（），即可判定为阳性。注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释
9、度不应超过1： 20,抗体浓度过低，会导致产生 的荧光过弱，影响结果的观察。2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足 够。染色温度多采用室温（259左右），高于37C可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用029的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37-C30 min效果好的多。3. 为了保证荧光染色的正确性，tr次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。（1）标本自发荧光对照：标本加”2滴0. 01mol/L, pH74的PBS.（2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗
10、体，再加荧光标记的特异性抗体。（3）阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。4. 一般标本在高压汞灯下照射超过就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本垠好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会 逐渐下降。间接免疫荧光法测抗体基本原理染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37C保温SOmin，便 抗 原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗1衣1出抗体。如果第一步 发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结
11、合抗原的抗体进一步结合.从而可鉴定未知抗体。试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS） : 0. 01mol/L, pH7.4 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9. 2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0. 01mol/L, pH74的PBS进行稀释 搪瓷桶三只（内有0. 01mol/L, pH74的PBS 1500ml） 有盖搪瓷危一只（内铺一层浸湿的纱布垫） 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37C温箱等。实验步骤1. 滴加0. 01nol/L, pH74的PBS于已知抗原标本10min后弃去，使标本片保持一定湿度。2. 滴加以0. 01mol/L, pH74的PBS
12、适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖摘瓷盒内，37*C 保温30mino3. 取出玻片，置于玻片架上，先用0. Olmol/L, pH74的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过OOlmol/L, pH74的 PBS三缸浸泡，每缸不时撮荡4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。5 将玻片平放在有盖搪瓷盒内，379保温30mine6卓复操作3。7. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。8. 荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。注意事项1. 荧光染色后一般在lh内完成观察，或于49保存4h,
13、时间过长，会使荧光械弱。2. 每次试验时，需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物(3) 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物3. 己知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特 异性荧光染色。1、问：用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同？参考见解：只是固定方法不同.细胞固定用甲醉，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。2、问：近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其
14、注盍：事项？参考见解：我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染.我的经验是：(1) 选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是 donkey ant 卜 rabbit-FITC (绿)donkey anti-rat-Tex-Red (红)(2) 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育 过夜比较好，背最比较清晰.(3) 我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物.(4) 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的
15、正常donk巳y血清.(5) 其余步骤同一般免疫荧光总标操作。3、 问：本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为FITC标记，想请教各位大侠：(1) 抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗空中进行？(2) 封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0,5mmol/LpH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等址混合封片？(3) 免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用？参考见解：(1) 你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光；(2) 封片最好用甘油加65mmol/LpH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明；(3) 关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3yoH02以去除内源性过氧化物酶；2N盐酸需要使2用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与己经掺入的Brdu结合.4、问：做间接法免疫荧光染色，如何设置对照？参
