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1、细胞糖胺多糖(GAG)总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)主要用途细胞糖胺多糖(GAG)总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测试剂是一种旨在通过高盐萃取 可溶性糖胺多糖，与二甲基亚甲基蓝染料结合，在丙醇解离溶液中，释放紫红色染料，由分光光度仪比色 分析，定量检测细胞样品中糖胺多糖含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明 的。适用于各种人体或动物细胞(皮肤、肌肉、软骨、肿瘤)等糖胺多糖水平检测。产品严格无菌，即到 即用，操作简捷，性能稳定，检测准确。技术背景糖胺多糖(glycosaminoglycan； GAG)，又称为粘多糖(mu
2、copolysaccharide),是体内最为丰富的异源多聚 糖。糖胺多糖是一种未分叉的负电荷性长链多聚糖，由重复的二糖单位，包括六碳糖(hexose)或己糖醛 酸(hexuronic acid)，链接到己糖胺(hexoamine)上而成。糖胺多糖与核心蛋白(core protein)共价相联, 构成蛋白多糖(proteoglycan； PG)，成为细胞膜和细胞外基质(extracellular matrix； ECM)的主要成分。 蛋白多糖的糖胺多糖在合成过程中发生硫酸酯化(sulfated group)，其部位在0或N位上，有利于发挥各种 不同的作用，包括酶的调节、细胞黏附、生长、迁移、分
3、化，以及组织损伤反应。基于糖胺多糖的高度负 电荷的特点，使用异染性(metachromatic，阳离子蓝色染料二甲基亚甲基蓝(1,9-dimethylmethylene blue； DMMB),在酸性条件下，特异性的结合产生不溶性紫色或粉红色糖胺多糖染料复合物(Dye-GAG complex)， 在丙醇解离溶液中，释放出染料，通过分光光度仪(656nm波长)测定，来定量分析糖胺多糖的总含量。产品内容清理液( Reagent A)毫升萃取液( Reagent B)毫升染色液( Reagent C)毫升解离液(Reagent D)毫升标准液( Reagent E)微升产品说明书1份保存方式保存 萃
4、取液(Reagent D，在一20C冰箱里；其余的保存在4C冰箱里；染色液(Reagent C)避免光照; 有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于样品操作的容器 15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器细胞刮脱棒：用于细胞脱离恒温水槽或干式恒温仪：用于样品反应 微型台式离心机：用于样品操作 比色皿或酶标板：用于比色分析的容器 分光光度仪或酶标仪：用于比色分析 实验步骤一、样品预处理1. 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 106细胞)2. 小心加入xx毫升 清理液(Reagent A),覆盖生长表面3. 小心抽去清理液4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注
5、意：可以使用胰酶消化)5. 加入 xx 毫升 清理液(Reagent A)，混匀细胞6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意：悬浮细胞从这一步骤开始)7. 放进4C台式离心机离心5分钟，速度为300g8. 小心抽去上清液9. 加入xx微升 萃取液(Reagent B)10. 放进一个 1.5 毫升离心管11. 强力涡旋震荡 1 分钟，充分混匀12放进56C恒温水槽孵育16小时13 .放进90C恒温水槽孵育10分钟14. 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g (或13000RPM，例如eppendorf 5415)15. 小心移取上清液到新的 1.5 毫升离心管16. 置于冰槽里
6、备用二、标准样品配制1. 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管2. 分别加入 xx 微升清理液(Reagent A)到1至5号管3 . 移取 xx 微升 标准液(Reagent E)到1号管，混匀4. 小心移取 xx 微升1号管稀释的 标准液(Reagent E)到2号管，混匀5. 小心移取 xx 微升2号管稀释的 标准液(Reagent E)到3号管，混匀6. 小心移取 xx 微升3号管稀释的 标准液(Reagent E)到4号管，混匀7. 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表管号清理液(Reagent A)标准液(Reagent E)标准糖胺多糖含量1xx微升xx微升xx微
7、克2xx微升xx微升1号管xx微克3xx微升xx微升2号管xx微克4xx微升xx微升3号管xx微克5xx微升00三、标准曲线测定1 移取 xx 微升上述配制的标准液（Reagent E）到1.5毫升离心管2 加入 xx 毫升 染色液（ Reagent C）3 涡旋震荡15秒4 室温下孵育30分钟，避免光照，期间每隔5分钟涡旋震荡15秒（注意：可见紫色或粉红色沉淀）5.即刻放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g6 小心抽去上清液（注意：确保没有水滴残留）7. 加入 xx 毫升 解离液（ Reagent D）8. 涡旋震荡15秒9. 室温下孵育5分钟，避免光照（注意：确保充分溶解）10
8、 .转移到新的比色皿11 即刻放进分光光度仪检测（波长656nm）：获得标准样品吸光读数12 .重复实验步骤 1 至 11 四次13构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准糖胺多糖含量（微克）四、样品测定1. 加入50微升上述制备的待测样品到1.5毫升离心管2. 加入xx毫升 染色液（Reagent C）3. 涡旋震荡15秒4. 室温下孵育30分钟，避免光照，期间每隔5分钟涡旋震荡15秒（注意：可见紫色或粉红色沉淀）5. 即刻放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g6. 小心抽去上清液（注意：确保没有水滴残留）7. 加入 xx 毫升 解离液（ Reagent D）
9、8. 涡旋震荡15秒9. 室温下孵育5分钟，避免光照（注意：确保充分溶解）10 .转移到新的比色皿11 即刻放进分光光度仪检测（波长656nm）：获得样品吸光读数12. 根据上述标准曲线获得样品对应糖胺多糖含量（微克）五、浓度计算注意事项1. 本产品为 25 次操作，包括标准样品2. 本产品不适合于非硫酸酯化的二糖降解片段、透明质酸（hyaluronate ）的检测3. 本产品可以检测硫酸软骨素（chondroitin sulfate）、硫酸角质素（keratan sulfate）、硫酸皮肤素（dermatan sulfate）、硫酸类肝素（heparan sulfate）等主要糖胺多糖4. 本产品检测范围为0.2至5微克糖胺多糖5. 操作时，须戴手套6. 系统操作时，标准样品测定只需 1 次7. 空白对照读数通常小于 0.06，如果超过表明抽去上清操作不当8 孵育时，避免光照9 如果样品糖胺多糖含量过低，可以浓缩样品或增加样品量至 100 微升 10样品浓度可以表述为：微克糖胺多糖/细胞量；微克糖胺多糖/细胞总蛋白等 11本公司提供系列糖类代谢检测试剂产品质量标准1 本产品经鉴定性能稳定2 本产品经鉴定检测敏感
