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1、细胞糖胺多糖(GAG)总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)主要用途细胞糖胺多糖(GAG)总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测试剂是一种旨在通过高盐萃取 可溶性糖胺多糖,与二甲基亚甲基蓝染料结合,在丙醇解离溶液中,释放紫红色染料,由分光光度仪比色 分析,定量检测细胞样品中糖胺多糖含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明 的。适用于各种人体或动物细胞(皮肤、肌肉、软骨、肿瘤)等糖胺多糖水平检测。产品严格无菌,即到 即用,操作简捷,性能稳定,检测准确。技术背景糖胺多糖(glycosaminoglycan; GAG),又称为粘多糖(mu
2、copolysaccharide),是体内最为丰富的异源多聚 糖。糖胺多糖是一种未分叉的负电荷性长链多聚糖,由重复的二糖单位,包括六碳糖(hexose)或己糖醛 酸(hexuronic acid),链接到己糖胺(hexoamine)上而成。糖胺多糖与核心蛋白(core protein)共价相联, 构成蛋白多糖(proteoglycan; PG),成为细胞膜和细胞外基质(extracellular matrix; ECM)的主要成分。 蛋白多糖的糖胺多糖在合成过程中发生硫酸酯化(sulfated group),其部位在0或N位上,有利于发挥各种 不同的作用,包括酶的调节、细胞黏附、生长、迁移、分
3、化,以及组织损伤反应。基于糖胺多糖的高度负 电荷的特点,使用异染性(metachromatic,阳离子蓝色染料二甲基亚甲基蓝(1,9-dimethylmethylene blue; DMMB),在酸性条件下,特异性的结合产生不溶性紫色或粉红色糖胺多糖染料复合物(Dye-GAG complex), 在丙醇解离溶液中,释放出染料,通过分光光度仪(656nm波长)测定,来定量分析糖胺多糖的总含量。产品内容清理液( Reagent A)毫升萃取液( Reagent B)毫升染色液( Reagent C)毫升解离液(Reagent D)毫升标准液( Reagent E)微升产品说明书1份保存方式保存 萃
4、取液(Reagent D,在一20C冰箱里;其余的保存在4C冰箱里;染色液(Reagent C)避免光照; 有效保证6月用户自备1.5毫升离心管:用于样品操作的容器 15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器细胞刮脱棒:用于细胞脱离恒温水槽或干式恒温仪:用于样品反应 微型台式离心机:用于样品操作 比色皿或酶标板:用于比色分析的容器 分光光度仪或酶标仪:用于比色分析 实验步骤一、样品预处理1. 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 106细胞)2. 小心加入xx毫升 清理液(Reagent A),覆盖生长表面3. 小心抽去清理液4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注
5、意:可以使用胰酶消化)5. 加入 xx 毫升 清理液(Reagent A),混匀细胞6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)7. 放进4C台式离心机离心5分钟,速度为300g8. 小心抽去上清液9. 加入xx微升 萃取液(Reagent B)10. 放进一个 1.5 毫升离心管11. 强力涡旋震荡 1 分钟,充分混匀12放进56C恒温水槽孵育16小时13 .放进90C恒温水槽孵育10分钟14. 放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g (或13000RPM,例如eppendorf 5415)15. 小心移取上清液到新的 1.5 毫升离心管16. 置于冰槽里
6、备用二、标准样品配制1. 准备好5个1.5毫升离心管,标记为1至5号管2. 分别加入 xx 微升清理液(Reagent A)到1至5号管3 . 移取 xx 微升 标准液(Reagent E)到1号管,混匀4. 小心移取 xx 微升1号管稀释的 标准液(Reagent E)到2号管,混匀5. 小心移取 xx 微升2号管稀释的 标准液(Reagent E)到3号管,混匀6. 小心移取 xx 微升3号管稀释的 标准液(Reagent E)到4号管,混匀7. 将1至5号管放进冰槽里备用;标准管浓度见下表管号清理液(Reagent A)标准液(Reagent E)标准糖胺多糖含量1xx微升xx微升xx微
7、克2xx微升xx微升1号管xx微克3xx微升xx微升2号管xx微克4xx微升xx微升3号管xx微克5xx微升00三、标准曲线测定1 移取 xx 微升上述配制的标准液(Reagent E)到1.5毫升离心管2 加入 xx 毫升 染色液( Reagent C)3 涡旋震荡15秒4 室温下孵育30分钟,避免光照,期间每隔5分钟涡旋震荡15秒(注意:可见紫色或粉红色沉淀)5.即刻放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g6 小心抽去上清液(注意:确保没有水滴残留)7. 加入 xx 毫升 解离液( Reagent D)8. 涡旋震荡15秒9. 室温下孵育5分钟,避免光照(注意:确保充分溶解)10
8、 .转移到新的比色皿11 即刻放进分光光度仪检测(波长656nm):获得标准样品吸光读数12 .重复实验步骤 1 至 11 四次13构建标准曲线:纵座标(Y轴)为吸光读数;横座标(X轴)为标准糖胺多糖含量(微克)四、样品测定1. 加入50微升上述制备的待测样品到1.5毫升离心管2. 加入xx毫升 染色液(Reagent C)3. 涡旋震荡15秒4. 室温下孵育30分钟,避免光照,期间每隔5分钟涡旋震荡15秒(注意:可见紫色或粉红色沉淀)5. 即刻放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g6. 小心抽去上清液(注意:确保没有水滴残留)7. 加入 xx 毫升 解离液( Reagent D)
9、8. 涡旋震荡15秒9. 室温下孵育5分钟,避免光照(注意:确保充分溶解)10 .转移到新的比色皿11 即刻放进分光光度仪检测(波长656nm):获得样品吸光读数12. 根据上述标准曲线获得样品对应糖胺多糖含量(微克)五、浓度计算注意事项1. 本产品为 25 次操作,包括标准样品2. 本产品不适合于非硫酸酯化的二糖降解片段、透明质酸(hyaluronate )的检测3. 本产品可以检测硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、硫酸角质素(keratan sulfate)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、硫酸类肝素(heparan sulfate)等主要糖胺多糖4. 本产品检测范围为0.2至5微克糖胺多糖5. 操作时,须戴手套6. 系统操作时,标准样品测定只需 1 次7. 空白对照读数通常小于 0.06,如果超过表明抽去上清操作不当8 孵育时,避免光照9 如果样品糖胺多糖含量过低,可以浓缩样品或增加样品量至 100 微升 10样品浓度可以表述为:微克糖胺多糖/细胞量;微克糖胺多糖/细胞总蛋白等 11本公司提供系列糖类代谢检测试剂产品质量标准1 本产品经鉴定性能稳定2 本产品经鉴定检测敏感