技术支持培训（PCR原理KASP原理TaqMan原理SNP分型及分析）

核酸提取&PCR技术&SNP基因分型技术与基因相关的概念染色体：棒状结构。是细胞内具有遗传性质的遗传物质深度压缩形成的聚合体，其本质主要是脱氧核糖核酸（DNA）和蛋白质的组合，是遗传物质的主要载体。DNA：双螺旋结构，是主要的遗传物质。贮存决定物种性状的全部遗传信息。基因：具有遗传效应的DNA片段，即具有生物学功能的DNA片段。基因突变：指基因在结构上发生或排列顺序的改变，一般为有害突变，少数为有利突变。单倍体、二倍体、多倍体单倍体、二倍体、多倍体染色体组：指细胞中的一组非同源染色体。单倍体：雄峰 16条染色体二倍体：人、大多数高等动物，一半左右的高等植物都是二倍体。多倍体小麦六倍体大豆、油菜四倍体Contents/1141磁珠法提取核酸原理2高通量自动化核酸提取3核酸提取方法核酸提取/115柱提取法：通过离心柱进行操作分离，又叫硅胶膜法。酚氯仿法/CTAB法/TPS法-仅使用离心管通用步骤1.处理样本-植物：液氮研磨/钢珠研磨 2.裂解：-破坏细胞膜等结构，将核酸释放。加入相应试剂，65度处理30 min。高速离心：12000转，10min.-将核酸与糖类、蛋白质等分离开。3.取上清加入试剂，静置，高速离心，12000转，10min.4.弃上清，用酒精沉淀。5.去酒精，干燥。6.洗脱：用超纯水或缓冲液进行洗脱。/118磁珠分离法磁珠分离法：一般用于自动化提取转移液体转移液体转移磁珠转移磁珠自动化核酸提取仪（内置磁场）Thermo KingFisher及大量国产仪器大型移液工作站（外置磁场）Hamilton、Beckman、Tecan、Agilent 特点：操作简便、体积小 磁棒振幅自由调节，使样本充分裂解 通过转移磁珠的方式使杂质残留最小化 性价比高 试剂盒全面兼容磁珠法磁珠法高通量自动化样本制备高通量自动化样本制备 特点：通量高，功能强大 大型工业客户应用广泛 试剂盒可兼容开放性平台 成本高260：DNA吸收峰 280：蛋白质吸收峰 230：盐、糖等吸收峰OD260/280 1.8-2 2说明有RNA或核酸降解 OD230/260 2左右 T突变 上游引物1-检测碱基C-FAM信号 上游引物2-检测碱基T-HEX信号若样本为CC纯合型，则扩增结束该反应孔仅被检测出FAM信号。若样本为CT杂合型，则扩增结束该反应孔同时检测出FAM和HEX信号。若样本为TT纯合型，则扩增结束该反应孔仅被检测出HEX信号。2.检测结果：一般称为分型图，横纵坐标为2种荧光信号，示例图横坐标为FAM信号，纵坐标为HEX信号。HEX纯合子杂合子FAM纯合子NTC备注：软件自动聚类需要在覆盖3种基因型或样本量够多的情况下，才能准确判断。其他情况下软件无法正确聚类，需要人工加以辅助判断。原始结果 软件分型结果SNP检测技术-KASP情况情况1：样本量较少或样本无法覆盖3种基因型，软件无法正确进行聚类分析，需要手工进行判断。情况情况2：理想情况下杂合子位置居中，个别情况下两条上游引物的扩增效率有差异，造成杂合子位置偏移，靠近某一个方向的纯合子。当检测样本较少或该批次样本中仅存在红色圈中的两种基因型时，软件计算不可靠，需要人工辅助判断，可能存在误判的情况。解决方法：与阳参结合，确定分型情况，阳参一般为基因型已知的样本或是根据序列合成的标准品。扩大检测样本量，3种基因型均存在的条件下，判断更加准确。未计算结果 人工判断 未计算结果 人工判断SNP检测技术-KASP优势：试剂里含有通用探针，只需合成多个针对具体位点的SNPPCR引物，就可以测许多位点。因为荧光探针、和淬灭探针都很贵，KASP方法相比于Taqman方法，可以通过通用荧光探针来代替针对位点的荧光探针，大大节约成本。劣势：KASP通用探针不开放，具有专利限制。SNP检测技术-KASP的优劣势SNP检测技术-PARMSPARMS（Penta-primeramplificationrefractorymutationsystem，五引物扩增受阻突变体系）是由武汉市景肽生物科技有限公司自主研发的新型SNP分子标记检测技术，具有完全自主的知识产权。PARMS是一种结合了一对通用荧光引物、一对SNP等位基因特异引物以及一条反向共用引物的SNPPCR分析技术。可快速简单地进行SNP等位基因基因型检测。注：#1，Allele 1 FAM荧光通用引物；#2，Allele 2 HEX 荧光通用引物；#3，Allele 1 特异扩增引物（标记引物）；#4，Allele 2 特异扩增引物（标记引物）；#5，Locus 特异扩增引物（标记引物）图1：PARMS SNP检测原理图2：PARMS SNP 检测技术流程PARMSSNP检测原理：带有2个不同的通用接头引物序列的Allele1和Allele2特异扩增引物(#3，#4)在DNA复性后与对应的SNPDNA模板结合，PARMSPCR酶和Buffer系统能保证严格的等位基因特异扩增，配合Locus特异扩增引物（#5），经过头2轮PCR后，形成了带有通用接头序列的PCR扩增产物。此时带有报告荧光以及荧光猝灭基团的通用探针（无扩增时因FRET效应而无荧光信号），可以以带有通用接头序列的PCR扩增产物作为模板进行PCR扩增，一旦扩增成功，荧光探针上的荧光猝灭基团与报告基团解离，FRET效应消失，此时进行荧光扫描，即可检测到对应的荧光信号，因而可以得知对应的等位基因是否存在。SNP检测技术-PARMSSNP检测技术-一代测序第一步：普通PCR扩增目的基因。目的基因长度150 bp,前后几十个bp不准确。第二步：用一条测序引物进行一代测序（Sanger法测序法测序又称双脱氧法测序）又称双脱氧法测序）常用实验体系-KASP方法KASP方法-正常实验方案烘干方案：提前喷样本板，37度放置10min。将方案中的DNA用水代替。常用水浴-KASP方法常用实验体系-Taqman方法常用水浴-Taqman方法数据展示：略差结果植物分型结果说明数据展示-批次间实验对比数据展示-较好结果-人类数据展示-较好结果-植物水稻大豆小麦针对已经验证的实验从大体系转移至小体系时或从Q-pcr转移至Gene Matrix时，大概率不会出现问题。问题：分型不佳或不扩增/无法分型验证：需以相同的试剂和样本板同时做对比实验，验证同批次试剂、样本以及操作。保证设备可用。1.排除加样问题，保证加样量正确。2.排除水浴问题，扩增条件保持一致，水温准确。3.排除分型问题，对于只有一种或2种基因型的分型结果，可调整软件坐标，达到视觉最优解决方法：1.微体系无扩增：可通过增加循环数进行观察。（对于扩增效率低的位点，微体系的循环数可能会长于Qpcr仪）2.无法分型或分型不清晰：可通过增加循环数进行观察。3.微体系分型清晰但不够聚拢，可通过增加循环数或增加ROX的浓度（不能过曝）或调整master软件坐标改善聚拢效果。Gene Matrix-问题分析针对未验证实验1.验证试剂在微体系可用在QPCR仪上进行2-3 ul体系的实验，若无正确结果，证明试剂不适合微体系。2.验证引物是否成功在QPCR仪上进行正常实验，若无扩增或无分型，证明引物不成功。若分型不佳可通过改变扩增条件来优化（KASP方法一般不改变扩增条件只改变循环数，Taqman方法可以通过调整退火温度、时间等）。3.微体系优化实验（试剂可用，引物成功）一般通过改变循环数或ROX的浓度（不能过曝）或master坐标来改善聚拢效果。Gene Matrix-问题分析Gene Matrix-操作培训基础操作培训：移液器、离心机、核酸浓度测定仪等一套微体系校准一套正常384孔板校准2组正常生物实验1组Stepone生物实验 1组正常384孔2ul体系实验Master使用分析Gene Matrix-考核理论：1.PCR过程及每一个过程的意义2.2.写出常用写出常用Taqman及及KASP方法反应体系及水浴方案。方法反应体系及水浴方案。3.Taqman及KASP方法的原理4.4.以以1个样本板个样本板4个位点做个位点做KASP方案为例，写出配液方案及水浴方案方案为例，写出配液方案及水浴方案。5.写出校准原理&校准方案6.分型不佳或不扩增/无法分型的主要原因7.实验室的污染来源及防控8.核酸提取的主要过程及意义操作：一套微体系校准达到标准一套正常384孔板校准达到标准1组正常生物实验达到标准：KASP&Taqman1组Stepone生物实验：KASP&TaqmanMaster实验分析手动加液1ul 1个96孔板scanner扫描荧光手动加液2ul 1个96孔板scanner扫描荧光手动加液5ul 1个96孔板scanner扫描荧光手动加液10ul 1个96孔板scanner扫描荧光1.写出PCR过程及每一个过程的意义2.Taqman及KASP方法的原理3.写出常用Taqman及KASP方法反应体系及水浴方案4.以1个样本板4个位点做嘉程方案为例，写出配液方案及水浴方案5.写出校准原理&校准方案实操1.1组正常生物实验达到标准：KASP&Taqman 4位点KASP：1/2/3/4 Taqman：rs671 rs 9984 rs7412 rs9358 2.微体系校准选做 1组Stepone生物实验：KASP&Taqman3个位点 rs671 rs7412 rs9358，每位点16个孔，共计48孔。