酶促反应动力学,吉林大学基础医学院生化教研室,Company Logo,酶促反应动力学实验目的,,,掌握酶促反应动力学研究的基本方法,1,4,,验证酶促反应动力学的部分理论,,2,Company Logo,酶促反应动力学,概念： 酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其影响因素反应速度：单位时间内底物减少或产物增加的量，常用初速度来衡量Company Logo,,Company Logo,影响酶促反应速度的因素：,底物浓度[S] 酶浓度[E] 反应温度 pH值 抑制剂 激活剂,Company Logo,酶促反应动力学实验内容,底物浓度对酶促反应速度的影响pH 对酶促反应速度的影响抑制剂 对酶促反应速度的影响竞争性抑制剂对酶促反应速度的影响 非竞争性抑制剂对酶促反应速度的影响,,Company Logo,酶促反应动力学实验原理,1、分光光度法 2、颜色反应(磷酸苯二钠法) 3、酶促反应动力学,Company Logo,Company Logo,酶:碱性磷酸酶(AKP)底物:磷酸苯二钠,磷酸苯二钠法,Company Logo,,磷酸苯二钠,酚,4－氨基安替吡啉,亚醌衍生物（紫红色）,酚,吸收峰 510nm,Company Logo,实验一,pH对酶促反应速度的影响,Company Logo,酶的最适pH: 酶催化活性最大时环境的pH。
2 8 10 pH,,,酶 的 活 性,pH对某些酶活性的影响 A: 胃蛋白酶; B: 葡萄糖-6-磷酸酶,pH对酶促反应速度的影响,A,B,Company Logo,,,,,,,,,,,,pH,A,Company Logo,,,实验操作,Company Logo,实验一,pH对酶促反应速度的影响,Company Logo,[操作步骤],反 应 体 系,,,试管,Company Logo,,,,,,,（加入酶液立即计时，迅速混匀）快，准,,37℃ 水浴15分钟,加入0.5Mol/L NaOH 1.0 ml(迅速混匀，终止反应),加入0.5％铁氰化钾2.0ml.(氧化作用)，充分混匀,室温放置10分钟,510nm比色，测定OD值(6号管校正零点),加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml,,,,Company Logo,实验二,底物浓度对酶促反应速度的影响,Company Logo,在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系V,20,,,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。
随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应当底物浓度高达一定程度,,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应,Company Logo,米－曼氏方程式,,※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)Company Logo,,,[S]： 底物浓度 V： 不同[S]时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm： 米氏常数(Michaelis constant),,,Company Logo,Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度Km值是酶的特性常数之一，只与酶的结构、底物和反应环境有关，与酶的浓度无关Company Logo,,Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比Company Logo,酶：碱性磷酸酶 底物：磷酸苯二钠 通过实验得到[S]与V之间的关系曲线 获得Km值,,[S] V 影响实验,Company Logo,,,Company Logo,,,,,1/V,1/[S],,1/Vmax,,- 1/Km,Ｋm值与Ｖmax值的测定,Company Logo,实验三,抑制剂对酶促反应速度的影响,Company Logo,抑制剂,概念：凡能使酶催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为抑制剂它与酶的活性部位结合，改变了酶活性部位的结构或性质，从而引起酶活力下降,Company Logo,不可逆性抑制,可逆性抑制 ：,1、竞争性抑制 2、非竞争性抑制 3、反竞争性抑制,,抑制作用的类型,酶活性中心 共价 不能用透析超滤方法去除,,非共价,Company Logo,竞争性抑制作用,定义：抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。
这种抑制作用称为竞争性抑制作用反应模式,,,,,,,,,,,,,S,S,E,E,I,I,E,E + P,,,,* 特点,抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度；,I与S结构类似，竞争酶的活性中心；,动力学特点：Vmax不变，表观Km增大抑制剂↑,,,,无抑制剂,1/V,1/[S],1/Vmax,-1/Km,Company Logo,非竞争性抑制,定义：抑制剂与底物的结构无关，结合在酶的活性中心以外的特定部位，使酶的活性降低这种抑制作用称为非竞争性抑制作用S,S,E,E,E,E + P,,,,S,E,,,,,,,,S,,,,,,,I,I,I,I,,,反应模式,,* 特点,抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系；,抑制程度取决于抑制剂的浓度；,动力学特点：Vmax降低，表观Km不变1/Vmax,-1/Km,,竞争性抑制,非竞争性抑制,Company Logo,反竞争性抑制,定义：抑制剂仅与酶和底物的中间复合物结合而抑制酶活性反应模式,,,,,,E,E,E + P,,E,,,,,I,I,,S,,,,,,S,S,,,,,,,,* 特点,1/Vmax,1/V,1/[S],无抑制剂,抑制剂↑,-1/Km,I与S分子结构不同,I只与ES结合；,动力学特点：Vmax表观Km都降低。
抑制程度取决于[I]和[ES]二者的浓度；,Company Logo,,,实验操作,Company Logo,实验二,底物浓度对酶促反应速度的影响,Company Logo,[操作步骤],反 应 体 系,,试管,Company Logo,,,,,,,（加入酶液立即计时，迅速混匀）快，准,,37℃ 水浴15分钟,加入0.5Mol/L NaOH 1.0 ml(迅速混匀，终止反应),加入0.5％铁氰化钾2.0ml.(氧化作用)，充分混匀,室温放置10分钟,510nm比色，测定OD值(9号管校正零点),加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml,Company Logo,实验三,抑制剂对酶促反应速度的影响,Company Logo,,竞争性抑制剂：Vmax不变 Km增大非竞争性抑制：Vmax减小 Km不变反竞争性抑制：Vmax减小 Km减小,Company Logo,酶：碱性磷酸酶底物：磷酸苯二钠抑制剂：暂时保密,Company Logo,[操作步骤],反 应 体 系,,试管,Company Logo,,,,,,,（加入酶液立即计时，迅速混匀）快，准,,37℃ 水浴15分钟,加入0.5N NaOH 1.0 ml(立即混匀，终止反应),加入0.5％铁氰化钾2.0ml.(氧化作用)，充分混匀,室温放置10分钟,510nm比色，测定OD值(9号管校正零点),加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml,Company Logo,实 验 结 果 的 处 理,1.以pH值为横坐标,OD值为纵坐标绘图,描述pH值对酶促反应速度影响，找出该酶的最适pH。
2.绘制底物浓度影响酶促反应的曲线，并求出Km值3.根据林－贝氏作图法 求出有抑制剂存在情况下的酶促反应的Km值，并判断本次实验为何种类型的抑制作用Company Logo,注意事项,加样器的正确使用 移液管的正确使用（特别注意每种试剂的专用管不可混用） 加样量的准确性 温度与时间的准确性 分光光度计的校准和使用,Company Logo,实验报告,实验目的 实验原理 实验步骤 实验结果 讨论 结论,。