·组织工程骨·骨髓基质干细胞与生物衍生骨复合修复 山羊胫骨缺损的研究戚超 杨志明 黄富国 秦廷武 李秀群 罗静聪 蔡琰【摘 要】 目的 探讨骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,M SCs)与生物衍生骨复合修复山羊胫骨的长段骨2骨膜缺损的可行性 方法 将12月龄山羊35只双侧胫骨制备成中段20 mm的骨2骨膜缺损,其中33只,将M SCs与生物衍生骨于体外复合培养后,将其植入右侧缺损处,常规钢板螺钉内固定作为实验组,以单纯生物衍生骨植入左侧作为对照组,另2只为空白组不植入任何材料,在2、4、6、8、12、16及24周各时间点分别行大体标本、 组织学观察,以及生物力学测试,比较3组骨缺损修复的能力 结果 4周时实验组支架材料部分吸收,植入物表面有纤维骨痂形成,对照组支架材料少量吸收,植入物表面有少量骨样组织形成; 8周时,大体标本、 组织学观察,实验组中的支架材料已完全降解,骨缺损部分修复,对照组中植入物两端少量新骨形成,材料中为纤维骨样组织,但8周时,实验组与对照组的生物力学强度差异无统计学意义(> 0. 05); 12周时,实验组骨缺损完全修复,对照组植入物两端有新骨包绕,与骨端连接紧密。
12～24周实验组弯曲应力大于对照组有统计学意义(P 0105)in the 8th week; the defects were perfectly repaired in the experi mental group and theeffects of biomechanics had statistically significant difference between two groups(P0105); 4、8、12、16及24周实验组评分均高于对照组,具有统计学意义(P< 0105) 实验组:术后2周,可见大量BrdU标记细胞位于 材料孔隙内,细胞核为圆形; 4周,材料部分降解,材料 孔隙内可见大量BrdU标记细胞与纤维结缔组织包 裹,胞核为梭形; 8周,材料完全被新骨代替,新骨骨小梁内有大量的BrdU标记细胞(图2 a)而对照组各时 间点均未发现BrdU标记细胞(图2 b)2. 4 生物力学检测 实验组和对照组在8、12、16和24周三点弯曲实 验中测得弯曲应力结果见表2;经统计分析:各时间点实验组弯曲应力结果均优于对照组,有统计学意 义(P< 0105)表1 两组不同时间点修复骨缺损组织学评分(n= 3,分,xθ±s)Tab.1 The results of tissue scoring of two groups(n= 3, deci,xθ±s)组别 Group时间 Ti me2周 2 weeks4周 4 weeks8周 8 weeks12周 12 weeks16周 16 weeks24周 24 weeks实验组 Experi mental group1. 462±0. 1203. 870±0. 18937. 100±0. 37839. 467±0. 318310. 670±0. 230311. 067±0. 3483对照组 Control group1. 113±0. 0671. 637±0. 0813. 660±0. 2415. 994±0. 2257. 826±0. 14910. 109±0. 4233与相同时间点对照组比较P值< 0. 053Compared w ith control group,P< 0. 05表2 两组不同时间点弯曲应力值比较(n= 3, M Pa,xθ±s)Tab 2. Comparison of the flexure stress between two groups(n= 3, M Pa,xθ±s)组别 Group时间 Ti me8周 8 weeks12周 12 weeks16周 16 weeks24周 24 weeks实验组 Experi mental group2. 27±0. 6133. 72±0. 7137. 27±0. 58314. 37±1. 673对照组 Control group1. 02±0. 152. 05±0. 703. 65±0. 8310. 03±1. 393与相同时间点对照组比较P值< 0. 053Compared w ith control group,P< 0. 05·29·Chinese J Reparative and Reconstructive Surgery, 2005, Vol 19(2)图1 术后8周组织学观察(HE×100)○a 实验组材料已吸收,有编织骨形成 ○b 对照组材料部分吸收,有纤维组织包裹 图2 术后8周组织化学观察(×200)○a 实验组BrdU标记的细胞开始成骨 ○b 对照组未发现BrdU标记的细胞Fig.1 Histological exam ination of the tissues 8 weeks after the operation(HE×100)○a Experi mental group: tissue engineering bone wascompletely absorbed, and woven bonewas observed ○b Control group: bio2derived bonewas partially absorbed, and fibrous tissuewas observed Fig.2 Histochem ical exam ination 8 weeks after operation(×200)○a Experi mental group: cells marked w ith BrdU began to from bone○b Control group: no cells marked w ith BrdU were observed3 讨论3. 1 实验模型的可靠性实验性骨缺损需要在一些不利于骨生长的环境中进行,如骨缺损为不能自行修复的长度,缺损部位血供差,红骨髓含量少的成年动物等。
我们选用12月龄成年山羊胫骨制备20 mm骨2骨膜缺损模型,缺损长度占山羊胫骨平均长度的25% ,胫骨位于皮下,局部肌肉覆盖少,为管状负重骨 截骨位置为距胫骨结节49～71 mm处的胫骨中段,远离红骨髓丰富的干骺端,这些因素均不利于骨缺损的自行修复 该实验中24周大体观察也未发现骨端向缺损区长入骨组织,髓腔已闭合,组织学检查见骨端增生不良,髓腔封闭,缺损区为纤维瘢痕组织,符合骨缺损的病理特征表明20 mm骨2骨膜缺损是山羊骨不能自行愈合,符合骨缺损的要求3. 2 组织工程骨的生物相容性生物衍生骨经冷冻、 脱脂、 去细胞、 去抗原和去蛋白等程序处理,除尚余一定的成骨诱导因子外,其主要成分为I型胶原,具有免疫抗原性低、 生物相容性好的特点[2, 3]该实验中发现, 2、4周实验组、 对照组材料孔隙内均只见少量淋巴细胞浸润;且2、4和8周组织工程骨内均有大量BrdU标记细胞存活,并能够快速成骨,表明组织工程骨生物相容性好,免疫原性低3. 3 种子细胞的成骨活性以往通过骨膜提取的细胞为已分化的成骨细胞,其成骨能力确切,但是取材有限,细胞量不足[4]从骨髓中分离培养M SCs具有多分化潜能,可在地塞米松、Β 2甘油磷酸钠等诱导下向成骨细胞分化,是构建组织工程骨的重要细胞。
骨髓可从髂骨穿刺中获得,取材方便,患者易于接受,且骨髓中还有多种活性因子,因此最有可能作为自体细胞构建的组织工程骨应用于临床[5, 6]我们将M SCs从山羊体内抽取后传至3代,经地塞米松、 Β 2甘油磷酸钠等诱导下分化为成骨细胞,以1×106?m l的密度接种于支架材料上,植入骨缺损处,从而使其发挥最大成骨活性在体内微环境影响、应力因素作用及血液供应等条件下,组织工程骨可同时发挥骨传导、 骨诱导及自身成骨作用从而使修复骨缺损速度加快·39·中国修复重建外科杂志2005年第19卷第2期3. 4 组织工程骨成骨作用 生物衍生骨经过了系统处理,祛除了抗原蛋白、 脂 质等,其主体框架结构无明显变化 我们以往的研究发 现,生物衍生骨孔隙率高,直径约200Λm,胶原框架有 效空间大,可有效地为种子细胞黏附、 分化及成骨提供更好的场所 由于生物衍生骨主要成分为I型胶原,植 入骨缺损区后,随着诱导成骨、 骨传导作用的完成,其 逐渐降解[729] 生物衍生骨含有骨形成蛋白等成骨诱导 因子,加快了成骨进程,其逐步降解的特点,与新骨形 成的病理过程相吻合[10, 11]该实验中组织学检测发现,生物衍生骨于4周开始降解,到8周时已完全吸 收,被新生骨组织代替。
故生物衍生骨符合作为构建组 织工程骨支架材料的要求 我们实验显示:实验组2、4周新骨已开始形成, 8、12周新骨代替支架材料,为软骨内成骨, 16周新骨塑形好,已成为成熟骨组织 表明组织工程骨修复能力较 单纯材料要强 而对照组支架材料降解较慢,且新骨形 成是由两骨端向中部生长,此为生物衍生骨的骨传导、 诱导作用所致 而生物力学测试也提示12、16、24周实 验组生物力学强度均高于对照组,表明组织工程骨成骨迅速,成骨量大,新骨塑形、 改建均较快,其骨修复能 力较对照组提前了8周 我们采用同种异体M SCs复合生物衍生骨移植修 复骨缺损,排斥反应少,效果好;能促进负重部位长段 管状骨缺损的修复,为进一步的组织工程骨的临床实验提供理论依据4 参考文献1Bonassar LJ, Vacanti CA.Tissue engineering: the first decadeand beyond. J CellBiochem Suppl, 1998, 30231: 2972303.2Darrouzet V , Fizet D, Dem iniere C,et al.Xenogeneic ossiculari mplants:an experi mental study of heterotopic, dem ineralized,lyophilized, porcine i mplants in the guinea2pig. Clin O tolaryngol,1999, 24(3): 1902197.3Bruder SP, Fox BS.Tissue engineering of bone. Cell basedstrategies. Clin O rthop, 1999, (367 Suppl) : S68283.4Breitbart AS, Grande DA , Kessler R,et al.Tissue engineeredbone repair of calvarial defects using cultured periosteal cells.Plast Reconstr Surg, 1998, 101(3): 5672574.5刘延青,娄思权.骨髓基质中的骨源性干细胞.中华骨科杂志,2000, 20(2): 1142116.6KollerMR, Papoutsakis ET. Cell adhesion in ani mal cell culture:physiologicalandfluid2mechanicali mplications.BioprocessTechnol, 1995, 20: 612110.7李裕标,杨志明,李秀群.成骨细胞与生物衍生材料联合培养的实验研究.中国修复重建外科杂志, 2002, 16(1): 57260.8杨志明,李彦林,解慧琪,等.生物衍生骨支架材料的组织相容性研究.中华整形外科杂志, 2002, 18(1): 628.9杨志明,李彦林,解慧琪,等.生物衍生骨复合成骨细胞体内异位成骨研究.中华创伤杂志, 2001, 17(8): 4752478.10秦廷武,杨志明,蔡绍哲,等.组织工程中细胞与材料的粘附作用.中国修复重建外科杂志, 。