Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,,,*,1,第一章、植物病原,(bìngyuán),真菌的分离、,培养及纯化技术,第一页，共六十五页2,1,）材料,(cáiliào),：,马铃薯,200g,、葡萄糖,20g,、琼脂,20g,、水,1000ml,1,、马铃薯葡萄糖琼脂,(qióngzhī),（,PDA,）培养基,马铃薯葡萄糖琼脂,(qióngzhī),：,potato dextrose agar,,简称,PDA,；马铃薯蔗糖琼脂：,potato sucrose agar,,简称,PSA,一、,真菌学研究中常见的,培养基的制作和灭菌,第二页，共六十五页3,第三页，共六十五页4,2,）制作步骤,马铃薯洗净，去皮称,200g,切块,/,条，,1000ml,水煮沸,30min,，,用双层纱布滤去薯块，,加入,15-20g,琼脂，加热熔化，再加,20g,葡萄糖，,待完全溶解后，趁热,(chèn rè),用双层纱布再过滤，,补水并定容到,1000ml,,分装于三角瓶或试管中，,塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。
第四页，共六十五页5,自然,pH,；,调,pH,值,， 也可用,1mol/L,的,NaOH,或,HCl,调至,pH,为,5.5,～,6.5,之间，最后加水补足至,1000mL,Tips:,,实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）含有较多的钙镁离子,(lízǐ),，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用第五页，共六十五页6,2,、植物组织和煎汁,,许多植物材料如豆荚,(dòujiá),、茎秆、种子等，可以放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即能做培养基使用植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养液，,如加琼脂即能制成固体培养基当然，必须,灭菌后,才能使用第六页，共六十五页7,3,、培养基的分装,根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管或三角瓶中试管分装时，使用玻璃漏斗装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的分装量为管高的,1/5,左右,，用三角瓶分装培养基时，容量不宜超过容积的,1/3----1/2,注意,(zhù yì),：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾湿棉塞而引起污染第七页，共六十五页。
8,制备好的培养基必须经过灭菌,(miè jūn),，方能使用4,、灭菌,(miè jūn),高压,(gāoyā),蒸汽灭菌：,15,磅,/,英寸或,1kg/cm,2,0.1Pa/cm,2,,,持续,15-30min,，培养基及其它一些用品可用此法灭菌分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、,晾干,/,烘干,、包装好，进行干热灭菌灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌,化学灭菌、以及辐射灭菌等第八页，共六十五页9,,滤膜孔径主要,(zhǔyào),有,0.22,µ,m,和,0.45,µ,m,两种过滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全第九页，共六十五页10,第十页，共六十五页11,5,、斜,面,面,(xiémi,à,àn),、平,板,板培,养,养基,的,的制,作,作,试管,培,培养,基,基,灭菌,后,后，,要,要趁,热,热斜,放,放先,先在,桌,桌上,放,放一,长,长木,板,板条,，,，然,后,后逐,个,个摆,放,放，,使,使培,养,养基,斜,斜面,长,长度,为,为试,管,管长,度,度的,2/5,至,3/5,，冷,凝,凝后,即,即成,斜,斜面,培,培养,基,基三角,瓶,瓶,中的,培,培养,基,基可,趁,趁热,倒,倒入,已,已灭,菌,菌的,培,培养,皿,皿中,，,，制,作,作平,板,板培,养,养基,。
方法,是,是,：将,培,培养,基,基冷,却,却至,45,～,50,℃,℃,（低,于,于,45,℃,℃,易凝,固,固，,应,应在,水,水浴,锅,锅中,加,加热,融,融化,）,），,左,左手,拿,拿培,养,养皿,，,，右,手,手拿,三,三角,瓶,瓶底,部,部，,用,用左,手,手小,指,指和,手,手掌,将,将三,角,角瓶,口,口的,棉,棉塞,拔,拔下,，,，并,握,握在,手,手中,，,，灼,烧,烧瓶,口,口片,刻,刻，,在,在酒,精,精火,焰,焰旁,将,将培,养,养皿,打,打开,一,一小,缝,缝，,使,使瓶,口,口正,好,好伸,入,入，,倾,倾入,培,培养,基,基约,15mL,，平,置,置、,凝,凝固,即,即成,注意,：,：操,作,作者,事,事先,必,必须,洗,洗净,手,手，,并,并用,70%,酒精,消,消毒,第十,一,一页,，,，共,六,六十,五,五页,12,二、,真,真菌,(zhēnj,ū,ūn),分离,植物,病,病原,菌,菌的,分,分离,(f,ē,ēnlí),培养,，,，是,植,植物,病,病理,实,实验,室,室工,作,作中,的,的基,本,本技,能,能第十,二,二页,，,，共,六,六十,五,五页,。
13,真菌,的,的分,离,离,---,就是,将,将所,需,需要,的,的真,菌,菌与,其,其它,杂,杂菌,分,分开,，,，供,给,给适,当,当的,条,条件,，,，使,它,它们,(t,ā,āmen),繁殖,而,而得,到,到纯,培,培养,一般,是,是根,据,据该,微,微生,物,物对,营养,、,、酸,碱,碱度,、,、氧,气,气,等条,件,件要,求,求不,同,同，,而,而供,给,给它,们,们适,宜,宜的,生,生活,条,条件,，,，即,让,让病,原,原菌,生,生活,在,在适,宜,宜的,培,培养,基,基上,，,，或,加,加入,某,某种,抑,抑制,剂,剂造,成,成只,利,利于,此,此菌,生,生长,，,，而,抑,抑制,其,其他,菌,菌生,长,长的,环,环境,，,，从,而,而,(c,ó,óng,é,ér),得到,纯,纯菌,株,株第十,三,三页,，,，共,六,六十,五,五页,14,观察,(guānchá),一种,真,真菌,病,病害,的,的标,本,本，,不,不一,定,定都,能,能检,查,查到,子,子实,体,体而,作,作,出,出,诊断,同时,，,，在,病,病部,表,表面,或,或组,织,织中,检,检查,到,到的,真,真菌,，,，有,时,时也,不,不能,断,断定,就,就是,它,它的,病,病原,物,物，,也,也有,可,可能,是,是植,物,物组,织,织死,亡,亡后,在,在上,面,面生,长,长的,腐生,性,性,真菌,。
因此,，,，对,有,有些,病,病害,病,病原,物,物的,确,确定,，,，最,好,好是,经,经过,分,分离,和,和培,养,养工,作,作，,且,且在,适,适当,的,的环,境,境下,进,进行,接,接种,试,试验,，,，确,定,定它,的,的致,病,病性,此外,，,，为,了,了,进一,步,步研,究,究真,菌,菌的,形,形态,、,、生,活,活史,、,、生,理,理和,生,生态,，,，或者,用,用于,发,发酵,如,如生,产,产抗,菌,菌素,等,等，,分,分离,而,而获,得,得真,菌,菌的,纯,纯培,养,养物,是,是必,要,要的,一,）,）目,的,的意,义,义,第十,四,四页,，,，共,六,六十,五,五页,15,分离,和,和培,养,养应,该,该在,无,无菌,至,至少,很,很清,洁,洁的,条,条件,(tiáojiàn),下进,行,行二,）,）、,真,真菌,分,分离,(f,ē,ēnlí),的程,序,序,1,．分,离,离前,的,的准,备,备,(zhǔnb,è,èi),工作,第十,五,五页,，,，共,六,六十,五,五页,16,1.1,清洁,环,环境,：,：,分离,工,工作,严,严格,说,说应,在,在无,菌,菌条,件,件,(tiáojiàn),下进,行,行，,无,无菌,室,室或,无,无菌,箱,箱是,分,分离,不,不可,缺,缺少,的,的设,施,施。
为了,(w,è,èile),保证,无,无菌,操,操作,，,，应,注,注意,下,下面,几,几点,：,：,1.2,若限,于,于条,件,件实,验,验只,能,能在普通,房,房间进行,时,时，,必,必须,对,对房,间,间进,行,行彻,底,底扫,除,除，,清,清洁,环,环境,、,、搞,好,好卫,生,生地,地上,多,多洒,些,些水,，以,消,消除,(xiāochú),室内,尘,尘埃,，,，工,作,作台,上,上铺,好,好,湿毛,巾,巾,，点,燃,燃酒,精,精灯,第十,六,六页,，,，共,六,六十,五,五页,17,1.3,分离,工,工作,开,开始,前,前最,好,好将,所,所需,的,的一,切,切用,品,品,(y,ò,òngp,ǐ,ǐn),都准,备,备好,，,，放,在,在超,净,净工,作,作台,内,内或,伸,伸手,可,可及,的,的台,外,外，,以,以避,免,免操,作,作过,程,程中,频,频繁,走,走动,，,，破,坏,坏环,境,境带,来,来杂,菌,菌；,1.4,保证,工,工作,人,人员,自,自身,的,的洁,净,净，,工,工作,前,前用,肥,肥皂,洗,洗手,；,；,1.5,无菌,操,操作,前,前还,要,要用,70,％酒,精,精擦,手,手；,1.6,工作,中,中，,特,特别,在,在进,行,行无,菌,菌操,作,作时,，,，呼,吸,吸要,轻,轻，,不,不要,说,说话,等,等。
第十,七,七页,，,，共,六,六十,五,五页,18,分离,材,材料,的,的选,择,择对,分,分离,培,培养,(p,é,éiy,ǎ,ǎng),的,成,成,败,败,有,有,着,着,决,决,定,定,的,的,影,影,响,响,病,害,害,材,材,料,料,应,应,尽,尽,可,可,能,能,新,新,鲜,鲜,，,如,如,可,可,选,选,择,择,新,近,近,发,发,病,病,的,植,植,株,株,、,、,器,器,官,官,或,或,组,组,织,织,作,作,为,为,分,分,离,离,的,的,材,材,料,料,，,，,可,可,以,以,减,减,少,少,腐,腐,生,生,菌,菌,的,的,污,污,染,染,最,好,好,在,在,病,病,、,、,健,健,交,交,接,接,处,处,选,选,材,材,取,取,样,样,病,病,、,、,健,健,交,交,接,接,处,处,，,，,除,除,材,材,料,料,新,新,鲜,鲜,，,，,污,污,染,染,的,的,可,可,能,能,性,性,小,小,外,外,，,，,病,病,原,原,菌,菌,的,的,生,生,活,活,力,力,强,强,、,、,比,比,较,较,活,活,跃,跃,，,，,容,容,易,易,分,分,离,离,成,成,功,功,。
2,．,分,分,离,离,材,材,料,料,(c,á,áili,à,ào),的,选,选,择,择,第,十,十,八,八,页,页,，,，,共,共,六,六,十,十,五,五,页,页,19,例,如,如,：,：,果,实,实,的,的,腐,腐,烂,烂,病,病,，,，,就,就,应,应,该,该,从,从,刚,刚,开,开,始,始,腐,腐,烂,烂,的,的,部,部,分,分,分,分,离,离,根,腐,腐,病,病,和,和,枯,枯,萎,萎,病,病,也,也,是,是,如,如,此,此,，,，,应,应,该,该,尽,尽,可,可,能,能,从,从,病,病,株,株,离,离,土,土,需,需,较,较,远,远,的,的,部,部,分,分,分,分,离,离,值,得,得,注,注,意,意,的,的,是,是,有,有,些,些,有,有,晕,晕,圈,圈,的,的,斑,斑,点,点,病,病,（,（,如,如,野,野,火,火,病,病,）,）,，,，,病,病,菌,菌,局,局,限,限,在,在,斑,斑,点,点,中,中,央,央,的,的,坏,坏,死,死,组,组,织,织,中,中,，,，,从,从,病,病,斑,斑,的,的,边,边,缘,缘,是,是,分,分,离,离,不,不,到,到,病,病,菌,菌,的,的,。
当,当,然,然,(d,ā,āngr,á,án),，,这,这,类,类,病,病,害,害,是,是,比,比,较,较,少,少,的,的,从,受,受,害,害,的,的,边,边,缘,缘,部,部,分,分,分,分,离,离,这,这,一,一,原,原,则,则,，,，,对,对,于,于,(du,ì,ìy,ú,ú),绝,大,大,部,部,分,分,病,病,害,害,都,都,是,是,适,适,用,用,的,的,第,十,十,九,九,页,页,，,，,共,共,六,六,十,十,五,五,页,页,20,,,采,得,得,的,的,材,材,料,料,如,如,已,已,经,经,败,败,坏,坏,(b,à,àihu,à,ài),而,沾,沾,染,染,大,大,量,量,的,的,腐,腐,生,生,菌,菌,，,，,有,有,时,时,可,可,以,以,采,用,用,接,接,种,种,后,后,再,再,分,分,离,离,的,的,方,方,法,法，,即,即,将,将,沾,沾,染,染,有,有,腐,腐,生,生,菌,菌,的,的,病,病,组,组,织,织,作,作,为,为,接,接,种,种,材,材,料,料,，,，,直,直,接,接,接,接,种,种,在,在,健,健,全,全,的,的,植,植,物,物,组,组,织,织,工,工,植,植,株,株,上,上,，,，,等,等,发,发,病,病,后,后,再,再,从,从,病,病,株,株,或,或,病,病,组,组,织,织,分,分,离,离,。
先,先,接,接,种,种,再,再,分,分,离,离,的,的,方,方,法,法,，,，,用,用,得,得,较,较,多,多,的,的,是,是,植,植,物,物,病,病,原,原,细,细,菌,菌,的,的,分,分,离,离,引,起,起,果,果,实,实,(gu,ǒ,ǒsh,í,í),和,蔬,蔬,菜,菜,腐,腐,烂,烂,病,病,的,的,真,真,菌,菌,，,，,如,如,腐,腐,霉,霉,属,属,(,Pythium,),和,疫,疫,霉,霉,属,属,(,Phytophthora,),的,真,真,菌,菌,，,，,用,用,这,这,种,种,方,方,法,法,分,分,离,离,的,的,效,效,果,果,也,也,很,很,好,好,分,离,离,烟,烟,草,草,的,的,根,根,腐,腐,病,病,菌,菌,(,Thielaviopsis,),，,用,用,这,这,种,种,方,方,法,法,效,效,果,果,也,也,很,很,好,好,，,，,将,将,烟,烟,草,草,种,种,子,子,播,播,在,在,培,培,养,养,皿,皿,中,中,的,的,吸,吸,水,水,纸,纸,上,上,，,，,然,然,后,后,(r,á,ánh,ò,òu),用,田,田,间,间,采,采,得,得,的,的,烟,烟,草,草,病,病,根,根,切,切,成,成,小,小,块,块,，,，,撒,撒,在,在,种,种,间,间,，,，,幼,幼,苗,苗,染,染,病,病,后,后,移,移,到,到,胡,胡,萝,萝,卜,卜,琼,琼,脂,脂,培,培,养,养,基,基,平,平,板,板,上,上,，,，,病,病,菌,菌,即,即,生,生,长,长,而,而,得,得,到,到,纯,纯,培,培,养,养,。
第,二,二,十,十,页,页,，,，,共,共,六,六,十,十,五,五,页,页,21,,（,1,）,酒,精,精,用酒,精,精,（,（,70%,）消,毒,毒,(xi,ā,āod,ú,ú),，,只,只,浸,浸,很,很,短,短,的,的,时,时,间,间,（,（,几,几,秒,秒,钟,钟,到,到,1,分,钟,钟,）,）,，,，,然,然,后,后,用,用,灭,灭,菌,菌,水,水,冲,冲,洗,洗,；,；,较,大,大,的,的,材,材,料,料往,往,往,是,是,在,在,酒,酒,精,精,中,中,浸,浸,过,过,后,后,，,，,或,或,用,用,棉,棉,花,花,塞,塞,蘸,蘸,酒,酒,精,精,涂,涂,在,在,组,组,织,织,表,表,面,面,，,，,然,然,后,后,都,都,在,在,火,火,焰,焰,上,上,将,将,酒,酒,精,精,烧,烧,去,去,3,．,组,组,织,织,(z,ǔ,ǔzh,ī,ī),的,表,表,面,面,消,消,毒,毒,剂,剂,第,二,二,十,十,一,一,页,页,，,，,共,共,六,六,十,十,五,五,页,页,22,,配,方,方,(p,è,èif,ā,āng),为,：,：,升,汞,汞,1g,，浓,盐,盐,酸,酸,2.5mL,，,加,水,水,至,至,1000mL,。
将,升,升,汞,汞,溶,溶,于,于,浓,浓,盐,盐,酸,酸,中,中,，,，,待,待,其,其,充,充,分,分,溶,溶,解,解,后,后,，,，,用,用,水,水,稀,稀,释,释,升,汞,汞,剧,剧,毒,毒,、,、,无,无,色,色,，,，,为,为,便,便,于,于,认,认,识,识,，,，,可,可,在,在,溶,溶,液,液,中,中,加,加,几,几,滴,滴,红,红,染,染,料,料,消,毒,毒,时,时,间,间,因,因,材,材,料,料,质,质,地,地,、,、,发,发,病,病,部,部,位,位,深,深,浅,浅,及,及,污,污,染,染,情,情,况,况,而,而,异,异,，,，,一,一,般,般,3,～,5,分,钟,钟,消,消,毒,毒,后,后,用,用,无,无,菌,菌,水,水,冲,冲,洗,洗,3,～,4,次,2,）,升,汞,汞,(sh,ē,ēn,ɡ,ɡ,ɡ,ɡ,ǒ,ǒn,ɡ,ɡ),溶,液,液,（,（,0.1%,）,第,二,二,十,十,二,二,页,页,，,，,共,共,六,六,十,十,五,五,页,页,23,（,3,）,次,氯,氯,酸,酸,钠,钠,NaClO,3,由,于,于,(y,ó,óuy,ú,ú),漂,白,白,粉,粉,的,的,成,成,分,分,不,不,固,固,定,定,而,而,影,影,响,响,其,其,消,消,毒,毒,效,效,果,果,，,，,目,目,前,前,多,多,改,改,用,用,次,次,氯,氯,酸,酸,钠,钠,.,消,毒,毒,所,所,用,用,的,的,浓,浓,度,度,一,一,般,般,是,是,3%-5%,的,水,水,溶,溶,液,液,，,，,消,消,毒,毒,时,时,间,间,5-15,分,钟,钟,。
幼,嫩,嫩,的,的病,组,组,织,织,，,，,表,表,面,面,用,用,药,药,剂,剂,消,消,毒,毒,时,时,可,可,能,能,会,会,同,同,时,时,杀,杀,死,死,其,其,中,中,的,的,病,病,原,原,真,真,菌,菌,，,，,消,毒,毒,时,时,间,间,应,应,尽,尽,量,量,缩,缩,短,短比,较,较,安,安,全,全,的,的,方,方,法,法,是,是,不,不,用,用,药,药,剂,剂,消,消,毒,毒,，,，,而,而,以,以,灭,灭,菌,菌,水,水,洗,洗,8,、,9,次,第,二,二,十,十,三,三,页,页,，,，,共,共,六,六,十,十,五,五,页,页,24,4,．,常,常,规,规,分,分,离,离,(f,ē,ēnl,í,í),方,法,法,植,物,物,病,病,原,原,真,真,菌,菌,的,的,分,分,离,离,方,方,法,法,主,主,要,要,有,有,两,两,种,种,：,：,组,织,织,分,分,离,离,法,法,和,稀,释,释,分,分,离,离,法,法,组,织,织,分,分,离,离,法,法,是,最,最,常,常,用,用,(ch,á,án,ɡ,ɡy,ò,òn,ɡ,ɡ),的,方,方,法,法,.,稀,释,释,分,分,离,离,法,法,主,要,要,用,用,于,于,病,病,组,组,织,织,上,上,产,产,生,生,大,大,量,量,孢,孢,子,子,的,的,病,病,原,原,真,真,菌,菌,的,的,分,分,离,离,。
第,二,二,十,十,四,四,页,页,，,，,共,共,六,六,十,十,五,五,页,页,25,植,物,物,病,病,原,原,真,真,菌,菌,的,的,分,分,离,离,一,一,般,般,都,都,是,是,用,用,组,组,织,织,分,分,离,离,法,法,就,就,是,是,切,切,取,取,小,小,块,块,病,病,健,健,组,组,织,织,，,，,经,经,表,表,面,面,消,消,毒,毒,和,和,灭,灭,菌,菌,水,水,洗,洗,过,过,以,以,后,后,，,，,移,移,殖,殖,在,在,琼,琼,脂,脂,培,培,养,养,基,基,平,平,板,板,上,上,培,培,养,养,切,取,取,组,组,织,织,的,的,大,大,小,小,要,要,适,适,宜,宜,，,，,一,一,般,般,可,可,将,将,较,较,大,大,(ji,à,àod,à,à),的,组,组,织,织,，,，,在,在,消,消,毒,毒,液,液,中,中,消,消,毒,毒,后,后,切,切,取,取,中,中,央,央,部,部,分,分,，,，,经,经,灭,灭,菌,菌,水,水,洗,洗,过,过,以,以,后,后,培,培,养,养,4.1,组,织,织,(z,ǔ,ǔzh,ī,ī),分,离,离,法,法,第,二,二,十,十,五,五,页,页,，,，,共,共,六,六,十,十,五,五,页,页,。
26,1,）,选,取,取,典,典,型,型,的,的,病,病,组,组,织,织,，,，,在,在,病,病,健,健,交,交,界,界,处,处,将,将,其,其,剪,剪,成,成,5mm,×,×5mm,的,小,小,方,方,块,块,若,若,干,干,，,，,装,装,于,于,火,火,焰,焰,灭,灭,菌,菌,(mi,è,èj,ū,ūn),的,小,小,碟,碟,中,中,注,:,选,择,择,新,新,患,患,病,病,的,的,组,组,织,织,作,作,为,为,分,分,离,离,的,的,材,材,料,料,，,，,可,可,以,以,减,减,少,少,腐,腐,生,生,菌,菌,混,混,入,入,的,的,机,机,会,会,腐,腐,生,生,菌,菌,一,一,般,般,在,在,发,发,病,病,很,很,久,久,而,而,已,已,经,经,枯,枯,死,死,或,或,腐,腐,败,败,的,的,部,部,分,分,滋,滋,生,生,，,，,因,因,此,此,，,，,一,一,般,般,斑,斑,点,点,病,病,害,害,应,应,在,在,临,临,近,近,健,健,全,全,组,组,织,织,的,的,部,部,分,分,分,分,离,离,植,物,物,病,病,原,原,真,真,菌,菌,的,的,组,织,织,(z,ǔ,ǔzh,ī,ī),分,离,离,的,技,技,术,术,与,与,步,步,骤,骤,：,：,第,二,二,十,十,六,六,页,页,，,，,共,共,六,六,十,十,五,五,页,页,。
27,2,）,向,装,装,有,有,病,病,组,组,织,织,的,的,小,小,碟,碟,中,中,加,加,入,入,70%,酒,精,精,（,（,约,约,半,半,碟,碟,）,）,进,进,行,行,表,表,面,面,消,消,毒,毒,，,，,十,十,几,几,秒,秒,后,后,倒,倒,掉,掉,酒,酒,精,精,注,:,先,用,用,70,％,的,的,酒,酒,精,精,浸,浸,2,、,3s,是,为,为,了,了,消,消,除,除,寄,寄,主,主,表,表,面,面,的,的,气,气,泡,泡,，,，,减,减,少,少,(ji,ǎ,ǎnsh,ǎ,ǎo),表,面,面,张,张,力,力,，,，,70,％,的,的,酒,酒,精,精,亦,亦,用,用,于,于,表,表,面,面,消,消,毒,毒,，,，,处,处,理,理,的,的,时,时,间,间,较,较,短,短,(,一,般,般,数,数,秒,秒,至,至,lmin),第二十,七,七页，,共,共六十,五,五页28,3,）向小碟,中,中加入,0.1%,升汞或,10%,次氯酸,钠,钠溶液,（,（约半,碟,碟）进,行,行表面,消,消毒，,处,处理时,间,间可自,30,秒至,3,分钟不,等,等，然,后,后倒掉,废,废液。
注：升,汞,汞溶液,消,消毒的,时,时间因,材,材料而,异,异，可,自,自,30s,至,30min,不等，,如,如植物,组,组织柔,嫩,嫩，则,表,表面消,毒,毒时间,宜,宜短；,反,反之,(fǎnzh,ī,ī),则可长,些,些一般,情,情况下,，,，需时,间,间,3,、,5min,第二十,八,八页，,共,共六十,五,五页29,4,）,向小碟,中,中加灭,菌,菌,(mi,è,è j,ū,ūn),水，冲,洗,洗,3-4,次（,除去残,留,留的消,毒,毒剂,）,，,将病组,织,织转移,到,到灭菌,滤,滤纸上,吸,吸去多,余,余的水,（,（,以大大,减,减少病,组,组织附,近,近出现,细,细菌污,染,染,）,第二十,九,九页，,共,共六十,五,五页30,5,）将吸,干,干水分,的,的病组,织,织,(zǔzhī),移到预,先,先倒好,的,的,PDA,平板上,，,，注意,要,要用,镊子轻,压,压组织,使其着,靠,靠在培,养,养基上,第三十,页,页，共,六,六十五,页,页31,6,）每皿,5,块，均,匀,匀摆放,，,，,倒置,于,25℃,培养箱,中,中培养,4-5,天后,(ti,ā,ānhòu),检查结,果,果。
写,明,明日期,、,、姓名,等,等第三十,一,一页，,共,共六十,五,五页32,各种真,菌,菌病害,发,发生,(fāshēng),的部位,和,和症状,不,不同，,其,其分离,要,要根据,具,具体情,况,况，采,用,用不同,的,的方法,，,，下面,介,介绍几,种,种典型,材,材料的,分,分离法,4.1.1,斑点,(bāndi,ǎ,ǎn),病病原,真,真菌的,分,分离,4.1.2,维管束,组,组织内,病,病原真,菌,菌,(zh,ē,ēnj,ū,ūn),的分离,4.1.3,根腐病,菌,菌的分,离,离,4.1.4,肉质组,织,织中病,菌,菌的分,离,离,4.1.5,种子内,病,病菌的,分,分离法,第三十,二,二页，,共,共六十,五,五页33,4.1.1,斑点病,病,病原,(bìngyuán),真菌的,分,分离,从病斑,切,切取每,边,边约,3-5mm,的小块,病,病组织,，,，用,70%,的酒精,浸,浸几秒,钟,钟，再,在,在,0.1%,的酸性,升,升汞,(sh,ē,ēnɡ,ɡ,ɡǒnɡ),水溶液,中,中浸,3-5,分钟；,而,而后用,灭,灭菌水,换,换洗,3,次，将,其,其移置,在,在琼脂,培,培养基,平,平板上,培,培养。
第三十,三,三页，,共,共六十,五,五页34,4.1.2,维管束,组,组织内,病,病原,(bìngyuán),真菌的,分,分离,第三十,四,四页，,共,共六十,五,五页35,从根茎,维,维管束,组,组织分,离,离病菌,，,，可先,将,将寄主,病,病部表,面,面用,70,％酒精,擦拭消,毒,毒，将,表,表皮组,织,织用灭,菌,菌的解,剖,剖刀削,去,去，然,后,后切取,其,其中小,块,块变色,的,的维管,束,束组织,，,，用升,汞,汞或漂,白,白粉液,消,消毒后,，,，用灭,菌,菌水冲,洗,洗,(ch,ō,ōngxǐ),几次，,移,移置培,养,养基面,上,上第三十,五,五页，,共,共六十,五,五页36,4.1.3,根腐病,菌,菌的分,离,离,根腐或,基,基腐病,菌,菌的分,离,离，由,材,材料的,大,大小决,定,定材料小,的,的可以,仿,仿照,(fǎngzhào),斑点病,的,的分离,法,法材料大,的,的则可,采,采用维,管,管束组,织,织内病,原,原真菌,的,的分离,法,法第三十,六,六页，,共,共六十,五,五页37,4.1.4,肉质组,织,织中病,菌,菌的分,离,离,多肉的,茎,茎、根,和,和果实,等,等，可,以,以,(kěyǐ),采用维,管,管束组,织,织内病,菌,菌的分,离,离法，,除,除去表,面,面组织,，,，切到,其,其中小,块,块病组,织,织分离,。
如有杂,菌,菌感染,(gǎnrǎn),可采用,“,直接接,种,种,”,法，待,出,出现症,状,状后，,用,用此法,再,再行分,离,离第三十,七,七页，,共,共六十,五,五页38,第三十,八,八页，,共,共六十,五,五页39,种子如,在,在,未破裂,的果荚,内,内，可,以,以,不经过,表面消,毒,毒，在,无,无菌的,条,条件下,取,取出移,在,在培养,基,基平板,(píngb,ǎ,ǎn),上培养,4.1.5,种子内病,菌,菌的分离,法,法,将整粒的,种,种子或种,子,子的一部,分,分进行表,面,面消毒（,升,升汞,(shēnɡ ɡ,ǒ,ǒnɡ),或漂白粉,）,），用灭,菌,菌水洗涤,后,后移在琼,脂,脂培养基,平,平板上培,养,养第三十九,页,页，共六,十,十五页40,稀释,(xīshì),法是微生,物,物学上最,早,早使用的,分,分离法，,主,主要用于,分,分离,细菌和酵,母,母菌,等4.2,稀释,(xīshì),分离法,植物,(zhíwù),病原真菌,的,的分离一,般,般很少用,稀,稀释法分,离,离，但有,些,些产生大,量,量,孢子的病原真,菌,菌和霉菌,，,，可以配,成,成孢子悬,浮,浮液稀释,分,分离。
第四十页,，,，共六十,五,五页41,方法：,用无菌水,从,从发病组,织,织表面冲,下,下孢子，,配,配成孢子,悬,悬浮液，,用无菌移,液,液管或滴,管,管吸取一,定,定体积的,菌,菌液至平,板,板培养基,上,上，,然后用无,菌,菌玻璃棒,将,将菌液轻,轻,轻的均匀,涂,涂布在整,个,个平板上,，,，或将菌,液,液移至无,菌,菌培养皿,中,中，然后,倾,倾入融化,后,后冷却至,45℃,的培养基,，,，,轻轻振荡,(zhèndàng),、平置、,凝,凝固后倒,置,置培养第四十一,页,页，共六,十,十五页42,4.2.1,孢子分离,法,法,产生大量,孢,孢子的病,菌,菌如青霉,属,属,(,Penicillium,),、交链孢,属,属,(,Alternaria,),、小丛壳,属,属,(,Glomerella,),、拟茎点,霉,霉属,(,Phomopsis,),及茎点属,(,Phoma,),等，则可,配,配制成孢,子,子悬浮液,,,以稀释法,或,或划线,(huáxiàn),法分离第四十二,页,页，共六,十,十五页43,许多真菌,的,的孢子在,成,成熟时有,弹射,的作用，,这,这样就可,以,以将产生,孢,孢子的材,料,料，放在,琼,琼脂培养,基,基平板的,下,下面,(xiàmian),或者悬挂,在,在上面，,便,便孢子弹,射,射在培养,基,基上而得,到,到纯培养,。
第四十三,页,页，共六,十,十五页44,典型的是,担,担子菌亚,门,门,(yàmén),大型真菌,担,担孢子的,分,分离和获,得,得：,担孢子无,色,色或有色,，,，浅色的,担,担孢子需,要,要成团堆,积,积时方能,辨,辨识，一,般,般是依靠,“,“孢子印,”第四十四,页,页，共六,十,十五页45,为了研究,一,一些真菌,在,在土壤中,存,存活和分,布,布的情形,，,，从有病,的,的土壤中,分,分离它们,是,是必要的,分离方法,是,是将土壤,取,取出少许,，,，配制成,悬,悬浮液，,然,然后用稀,释,释,(xīshì),法或划线,法,法分离4.2.2,土壤,(tǔr,ǎ,ǎng),带菌分离,法,法,第四十五,页,页，共六,十,十五页46,稀释,(xīshì),倒平板法,示,示意图,第四十六,页,页，共六,十,十五页47,稀释,(xīshì),涂布法示,意,意图,第四十七,页,页，共六,十,十五页48,,,,1.dilutesample,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1 ml,9 ml,10100 100010,4,10,5,10,6,10,7,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2. plateout0.1ml,平板,(píngbǎn),稀释法,第四十八,页,页，共六,十,十五页。
49,图 平,板,板划线,(huáxiàn),分离法,1.,斜线法,2.,曲线法,3.,方格法,4.,放射法,5.,四格法,第四十九,页,页，共六,十,十五页50,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,平板,(píngbǎn),划线方法,示,示意图,第五十页,，,，共六十,五,五页51,分离真菌,时,时经常有,细,细菌,(xìj,ū,ūn),污染将,培,培养基调,节,节至酸性,反,反应，如,在,在,10ml,培养基中,加,加,1-2,滴,25%,的乳酸，,可,可使大部,分,分细菌受,到,到抑制，,而,而并不影,响,响真菌的,生,生长4.3,细菌,(xìj,ū,ūn),污染的排,除,除,第五十一,页,页，共六,十,十五页52,培养基中,加,加适当的,抗,抗菌素是,抑,抑制细菌,生,生长很有,效,效的方法,加金霉素,(30ug/ml),可抑制多,数,数细菌的,生,生长，,加,青霉素,(20ug/ml),可抑制革,兰,兰氏阳性,细,细菌的生,长,长，,加,多粘霉素,B,(5.0ug/ml),可抑制,G,—,阴性细菌,的,的生长，,加,链霉素,(40ug/ml),或,氯霉素,(50ug/ml),可以抑制,大,大部分细,菌,菌的生长,。
除去,氯霉素,可在灭菌,前,前加入外,，,，其他抗,菌,菌素都应,在,在培养基,灭,灭菌后并,冷,冷却到,45℃,左右时加,入,入,(,以手背触,三,三角瓶感,到,到,(gǎndào),烫，但尚,可,可以忍耐,为,为宜,),第五十二,页,页，共六,十,十五页53,5,、内生真,菌,菌的分离,先将健康,组,组织，如,：,：叶片和,茎,茎，用自,来,来水冲洗,干,干净、晾,干,干水分后,,,剪成约,1.5cm×1.5cm,的小片,(,叶,),或,1.5cm,长的小段,(,茎,),按下列,(xiàliè),程序进行,表,表面消毒,:,70%,酒精漂洗,30s→0.1%,升汞漂洗,1min,→,→70%,酒精漂洗,30s→,无菌水冲,洗,洗,4,次，在无,菌,菌滤纸上,吸,吸干水分,将上述处,理,理过的材,料,料在无菌,状,状态下剪,切,切成,0.5cm×0.5cm,小片（剪,去,去,0.5cm,的边缘）,，,，或,0.3~0.5cm,长段移植,于,于含链霉,素,素的供试,培,培养基上,（,（,PDA,、,Czapek,、煎汁培,养,养基）,,,于,26±1,℃,℃,黑暗条件,下,下培养，,待,待组织块,边,边缘有菌,丝,丝长出后,，,，及时挑,取,取菌丝尖,端,端转入,PDA,平板上培,养,养。
第五十三,页,页，共六,十,十五页54,用丝瓜诱,发,发,(yòufā),瓜果腐霉,：,：,Pythiumaphanidennatum,6,、土壤,(tǔr,ǎ,ǎng),真菌的诱,发,发技术,与步骤：,E,、进一步,纯,纯化，保,存,存,(bǎocún),备用D,、在,25℃,下放置,4-5,天后，瓜,上,上长出大,量,量白色棉,絮,絮状的菌,丝,丝体，即,为,为所需真,菌,菌C,、将丝瓜,切,切段，切,口,口端插入,土,土中B,、加入少,量,量自来水,，,，将菜园,土,土混合成,糊,糊状A,、将菜园,土,土装于玻,璃,璃杯中（,约,约半杯）,第五十四,页,页，共六,十,十五页55,1,）先用剪,刀,刀,(jiǎndāo),将每粒大,麻,麻籽一分,为,为二，然,后,后在水中,煮,煮沸，进,行,行简单灭,菌,菌7,、水生真,菌,菌的诱发,技,技术,(jìshù),与步骤：,4,）进一步,纯,纯化，保,存,存,(bǎocún),备用3,）,2,天后开始,换,换水，即,将,将培养皿,中,中的混合,水,水全部倒,掉,掉，再加,入,入约,15ml,灭菌水，,以,以后每天,换,换灭菌水,一,一次，一,般,般,4-5,天后即可,从,从大麻籽,上,上长出菌,落,落，通常,为,为,Saprolegnia,spp.,或,Achlya,spp.,。
2,）每人取,3,个灭菌培,养,养皿，在,每,每一培养,皿,皿中加入,3-4,瓣经简单,灭,灭菌的大,麻,麻籽，然,后,后分别加,入,入,14,、,12,、,10ml,灭菌水，,再,再分别加,入,入,1,、,3,、,5ml,池塘水，,置,置,25℃,培养第五十五,页,页，共六,十,十五页56,分离工作,有,有时不很,顺,顺利，,失败的原,因,因,很多，以,下,下几点值,得,得首先加,以,以考虑：,（,1,）材料是,否,否新鲜,(xīnxiān),，标本中,的,的病菌是,否,否存活，,其,其中杂菌,滋,滋生的情,况,况；,（,2,）表面消,毒,毒所用的,药,药剂和处,理,理方法是,否,否适宜；,（,3,）培养基,是,是否适当,，,，包括它,的,的化学性,状,状和物理,性,性状；,（,4,）培养的,条,条件是否,适,适宜，受,低,低温、高,温,温和其他,因,因子的影,响,响；,（,5,）病原生,物,物的生物,学,学特点，,它,它对于腐,生,生条件的,适,适应能力,,（三）分,离,离结果,(jiēguǒ),与分析：,第五十六,页,页，共六,十,十五页57,三、培养,(péiyǎng),culture,病原物的,培,培养,，即将分,离,离的病原,菌,菌移到可,以,以让这种,病,病原菌正,常,常生长,(shēngzh,ǎ,ǎng),的营养基,质,质即培养,基,基上，从,而,而获得其,纯,纯培养。
第五十七,页,页，共六,十,十五页58,每皿组织,块,块均匀,(jūnyún),摆放，干,水,水，轻压,；,；,培养皿倒,置,置或正放,；,；,于,25℃-27 ℃,培养箱中,培,培养；,黑暗或光,照,照，或光,暗,暗交替；,日光灯，,紫,紫色光，,黑,黑光灯等,；,；,2-3,天后检查,结,结果；,写明日期,、,、姓名等,第五十八,页,页，共六,十,十五页59,1,．菌落的,质,质地；,2,．菌落是,凸,凸起的还,是,是成簇的,菌,菌丝体；,菌,菌丛密集,及,及繁茂程,度,度、,3,．形成成,堆,堆的孢子,是,是干性的,还,还是粘性,的,的；,4,．各种子,实,实体和休,眠,眠结构,(jiégòu),（厚垣孢,子,子、菌核,等,等）的形,成,成,及所需的,时,时间；,5,．菌落正,、,、背面的,颜,颜色，有,无,无色素分,泌,泌出来而,渗,渗入培养,基,基中；,6,．有无特,殊,殊气味；,7,．菌落中,有,有无部分,呈,呈扇形；,8,．生长率,的,的快慢，,如,如菌落长,到,到一定直,径,径所需的,时,时间9.,培养基种,类,类,(,成分及,pH),10.,培养温度,11.,光照条件,。
真菌培养,(péiyǎng),性状观察,观察,(guānchá),和记载以,下,下内容：,第五十九,页,页，共六,十,十五页60,1,．菌丝块,法,法,一般从形,成,成的菌落,的,的边缘挑,取,取菌丝体,移,移植培养,，,，这也有,一,一定的纯,化,化,(chún hu,à,à),作用四、真菌,(zhēnjūn),菌种的纯,化,化,对一种真,菌,菌在进行,深,深入研究,以,以前，菌,种,种的纯化,是,是必要的,此外，,研,研究真菌,的,的遗传和,变,变异、性,征,征和同宗,或,或异宗,(yìzōnɡ),配合等现,象,象，都要,求,求菌种从,单,单个孢子,（,（或小段,顶端菌丝,）繁殖而,来,来第六十页,，,，共六十,五,五页61,这种方法,(fāngfǎ),实质上是,分,分离菌落,，主要用,于,于,细菌和酵,母,母菌等菌种的,纯,纯化，但,不,不能看到,和,和确定一,个,个菌落是,从,从单个孢,子,子繁殖而,来,来，纯化,的,的可靠性,较,较差同,时,时，这种,方,方法也不,能,能用来分,离,离特定的,孢,孢子2,．单菌落,法,法,将菌种上,产,产生的孢,子,子用灭菌,(mièjūn),水洗下，,适,适当稀释,后,后，取一,定,定量的孢,子,子悬浮液,与,与熔化后,冷,冷却到,45℃,左右的琼,脂,脂培养基,充,充分混合,，,，倒平板,培,培养，从,形,形成的单,个,个分散的,菌,菌落上移,植,植菌丝体,培,培养。
第六十一,页,页，共六,十,十五页62,3,．稀释法,将孢子悬,浮,浮液加适,量,量的灭菌,水,水，不断,稀,稀释到每,一,一小滴悬,浮,浮液中,大致只有,1,个孢子,移植到适,当,当的培养,基,基上培养,此方法操,作,作,(cāozuò),比较麻烦,，,，但是比,前,前一种分,离,离法可靠,第六十二,页,页，共六,十,十五页63,孢子悬浮,液,液中孢子,调,调节到适,当,当的数量,，,，再涂匀,在,在琼脂平,板,板表面上,用玻璃,针,针、金属,(jīnshǔ),针或其他,器,器具在显,微,微镜下观,察,察和挑取,4,．,琼,琼,脂,脂,(qi,ó,óngzh,ī,ī),平,板,板,表,表,面,面,单,孢,孢子,挑,挑,取,取,法,法,有,时,时,可,可,以,以,等,等,到,到,孢,孢,子,子,萌,萌,芽,芽,产,产,生,生,短,短,芽,芽,管,管,后,后,再,再,挑,挑,取,取,孢,孢,子,子,萌,萌,芽,芽,后,后,容,容,易,易,看,看,到,到,和,和,挑,挑,取,取,，,，,尤,尤,其,其,是,是,有,有,利,利,于,于,分,分,离,离,小,小,而,而,无,无,色,色,(w,ú,ús,è,è),的,孢,孢,子,子,，,，,还,还,可,可,以,以,保,保,证,证,分,分,离,离,到,到,的,的,孢,孢,子,子,是,是,活,活,的,的,。
第,六,六,十,十,三,三,页,页,，,，,共,共,六,六,十,十,五,五,页,页,64,第,六,六,十,十,四,四,页,页,，,，,共,共,六,六,十,十,五,五,页,页,内,容,容,(n,è,èir,ó,óng),总,结,结,1,组,组,织,织,分,分,离,离,法,法,和,和,稀,稀,释,释,分,分,离,离,法,法,就,就,是,是,切,切,取,取,小,小,块,块,病,病,健,健,组,组,织,织,，,，,经,经,表,表,面,面,消,消,毒,毒,和,和,灭,灭,菌,菌,水,水,洗,洗,过,过,以,以,后,后,，,，,移,移,殖,殖,在,在,琼,琼,脂,脂,培,培,养,养,基,基,平,平,板,板,上,上,培,培,养,养,D,、,、,在,在25,℃,℃,下,下,放,放,置,置4-5,天,天,后,后,，,，,瓜,瓜,上,上,长,长,出,出,大,大,量,量,白,白,色,色,棉,棉,絮,絮,状,状,的,的,菌,菌,丝,丝,体,体,，,，,即,即,为,为,所,所,需,需,真,真,菌,菌,3,）,）,培,培,养,养,基,基,是,是,否,否,适,适,当,当,，,，,包,包,括,括,它,它,的,的,化,化,学,学,性,性,状,状,和,和,物,物,理,理,(w,ù,ùl,ǐ,ǐ),性,状,状,。
4,）,）,培,培,养,养,的,的,条,条,件,件,是,是,否,否,适,适,宜,宜,，,，,受,受,低,低,温,温,、,、,高,高,温,温,和,和,其,其,他,他,因,因,子,子,的,的,影,影,响,响,于,于25,℃,℃-27,℃,℃,培,培,养,养,箱,箱,中,中,培,培,养,养,64,第,六,六,十,十,五,五,页,页,，,，,共,共,六,六,十,十,五,五,页,页,。