卵巢癌铂类药物化疗卵巢癌铂类药物化疗 耐药机制研究进展耐药机制研究进展【关键词】 卵巢癌 铂类药物 化疗 耐药性化学药物治疗是治疗妇科恶性肿瘤特别是卵巢癌的重要手段之一自上世纪 80 年代初铂类抗癌药问世以来,卵巢癌的疗效,尤其是近期效果,有较明显的改观上皮性 III 期卵巢癌,手术+铂类药物化疗,中位生存期从 12～18 个月提高到 24 个月［1］ 目前,常采用的化疗方案有 CAP、CBP、TP、TTP 及 VBP 等,均包含铂类药但这些方案治疗后达临床缓解者,复发率仍高达 50%以上在卵巢癌的化疗中铂类化合物(如顺铂及卡铂)是诸多药物中最有效的,近来的研究表明铂类药物的细胞毒作用是通过形成了铂-DNA 络合物,导致 DNA 致命的损伤,诱导细胞凋亡(apoptosis)而发挥作用但是肿瘤的耐药性又始终是影响化疗效果的最大障碍,且对于耐药问题的研究目前多局限于对卵巢癌细胞系方面,而在临床方面的研究却并不多见,综合各家观点,卵巢癌对铂类药物耐药性产生的机制可能和以下因素有关１ 相关染色体变化Takano 等［2］用比较基因组杂交技术筛选顺铂耐药细胞系中异常染色体区,发现染色体 6q21～25 区复制水平升高,而7q21～36 区和 10q12～15 区复制水平降低。
同时研究 28 例原发性上皮性卵巢癌患者,发现在耐药组患者中广泛存在1q21～22 、13q12～14 区功能增强故认为这些区域的基因变化可能是潜在耐药性标志２ 相关基因变化Sakamoto 等［3］应用 cDNA 微阵列对卵巢癌顺铂敏感株 KF 和耐药株 KFr、KFrP200 进行研究,发现谷氨酰转肽酶的 mRNA表达随顺铂耐药性的升高而升高在对顺铂 3 倍耐药的 KFr 中与 DNA 修复有关的基因 XRCC5、XRCC6、ERCC5、hMLH1 等过表达,在对顺铂 30 倍耐药的 KFrP200 中凋亡抑制基因胰岛素样受体Ⅰ(IGFRⅠ)、IGFRⅡ均过表达,而凋亡诱导因子 caspase3、Bak表达受抑制酵母菌中含有一种富含丝氨酸精氨酸蛋白特异性激酶1(Serine/arginine 2 rich protein 2 specific kinasefrom budding yeast,SKY1),Schenk 等［4］发现该激酶的功能受到破坏后可导致细胞对顺铂耐药而将 SKY1 的同系物人富含丝氨酸精氨酸蛋白特异性激酶(Serine/arginine 2 rich protein 2 specific kinase,SRPK1)表达于 SKY1 缺失突变的酵母菌中其仍具有对顺铂的敏感性,因此提示 SRPK1 是一种顺铂敏感性基因。
而在人卵巢癌 A2780 细胞中应用 SRPK1 的反义脱氧寡核苷酸链阻止 SRPK1 翻译起始区,可导致 SRPK1 表达下调,并使其对顺铂的耐药性提高 4这表明 SRPK1 基因与顺铂诱导的细胞死亡有关,可作为研究临床耐药的重要方面Pan 等［5］在顺铂敏感株 A2780 和耐药株 C30 中分别应用 ISIS、10582(一种 c2jun 反义脱氧寡核苷酸),在 C30 中观察到 c2jun mRNA 的表达水平下降,且2 谷氨酰半胱氨酸合成酶 mRNA 的表达也下调,细胞内谷胱甘肽水平下降,但在 A2780 中未见到2 谷氨酰半胱氨酸合成酶 mRNA 下降用四氮唑蓝比色法显示 C30 中的顺铂 50%抑制浓度(IC50)在应用 c2jun 反义链后由 18.2mmol/L 降至3.7mmol/L而 A2780 暂时转染 c2jun 表达载体后 c2jun 的蛋白含量升高 9.2 倍,谷胱甘肽浓度升高 10.7 倍,顺铂的 IC50 升高2 倍故由此推论转录因子 c2jun 表达的调节对耐药起作用Sellar 等［6］发现同源框基因 BARX2 在顺铂敏感株中的表达高于耐药株,在顺铂治疗后又复发的患者中该基因表达下调。
而转染 BARX2 基因可使顺铂耐药株对顺铂敏感性明显增加由此可见,该基因在决定细胞对顺铂毒性的敏感性方面有一定作用３ 凋亡相关因子IAP 家族是新发现的一组凋亡蛋白抑制因子,通过抑制 caspase发挥蛋白水解酶作用而阻止细胞凋亡,家族成员主要包括:NIAP、XIAP、HIAP21、HIAP22 和 survivinLi 等［7］应用顺铂敏感株 OV2008、A2780S 和耐药株 C13、A2780CP 研究发现,XIAP 和 HIAP22 在卵巢癌增生细胞中呈高表达,但在凋亡细胞中无表达顺铂可持续降低敏感株内 XIAP 蛋白表达且诱导凋亡,但在耐药株中顺铂不能改变 XIAP 和 HIAP22 的量,也不能诱导凋亡用腺病毒转染而致的 XIAP 过表达在敏感株中可以减少顺铂诱导的细胞凋亡XIAP 反义链表达可诱导耐药株和敏感株细胞凋亡,但在后者作用要强这表明在卵巢癌中 XIAP 是肿瘤生长控制的重要因素,并且可能是顺铂诱导凋亡的一个调节点而顺铂下调XIAP 的作用可能是化疗敏感性的重要方面Mansouri 等［8］用顺铂敏感细胞株 2008 和其耐药亚克隆 2008C13 进行研究,发现顺铂耐药性与 XIAP 基因表达增强有关。
而在 2008C13 中应用顺铂后 Fas2L 的作用消失在顺铂敏感株中,XIAP 不能激活,但凋亡诱导剂 Fas2L 表达却升高表明 XIAP 表达和 Fas2L 下调参与了卵巢癌中顺铂耐药,且在其中可能代表一种新的抗凋亡机制4 顺铂细胞内蓄积影响因素通过对卵巢癌细胞系的研究,发现卵巢癌细胞的耐药表型可能和细胞内铂类化合物的蓄积减少有关xc2 运输系统是一种异二聚体氨基酸运输载体,由 xCT 和 4F2hc两种蛋白组成,在介导胱氨酸摄入同时伴随着细胞内谷氨酸排出,并可调节谷胱甘肽水平Okuno 等［9］应用顺铂敏感株 A2780 和耐药株 A2780/DDP 研究发现,在 A2780/DDP 细胞内谷胱甘肽水平明显升高,而且胱氨酸的摄取速度是 A2780 的 4.5 倍A2780/DDP 中胱氨酸摄取速度是由 xc 系统来介导的,但在细胞有过量谷氨酸时,谷胱甘肽水平明显下降,从而抑制胱氨酸摄取在 A2780/DDP 中,xCT 和 4F2hc 的 mRNA 有明显表达,但在 A2780细胞中表达明显减少而 A2780 细胞转染 xCT 和 4F2hc 后对顺铂的耐受性升高由此推论 xc 系统通过保持细胞内高水平谷胱甘肽来介导顺铂耐药。
Komuro 等［10］研究了 3 种卵巢癌细胞系即 KF(顺铂敏感)、RTSG(内在耐药)、KFra (获得性顺铂耐药),并分别对其应用顺铂加紫杉醇和顺铂加 SN238(伊立替康的一种活性代谢产物)的联合化疗,发现联合用药时药物的抗癌性有协同作用在 KF 中观察到时间依赖性的顺铂蓄积而在 KFra 中顺铂的量却下降,RTSG 中则几乎见不到顺铂的蓄积,提示耐药性与顺铂的蓄积有关在应用紫杉醇和 SN238 后 3 种细胞中均见到顺铂蓄积在 KF、KFra 两种细胞株中,应用钠钾 ATP 酶阻滞剂毒毛花甙 G 可以减少顺铂的蓄积,同时可抑制紫杉醇 SN238 增加顺铂蓄积的作用研究还显示顺铂联用紫杉醇和 SN238 可下调多药耐药蛋白 mRNA 表达,而顺铂单用可以上调其表达,结果提示紫杉醇和 SN238 可通过改变顺铂细胞内蓄积(包括药物摄入和外流)以及对多药耐药蛋白表达的影响来克服耐药性Katano 等［11］的研究应用 3 对人卵巢癌细胞系(A2780、2008、IGROV21 和相应耐药株 A2780/ CP、2008/ C13*5. 25 IGROV21/CP)发现顺铂耐药与铜有交叉耐受。
应用顺铂 1h 后耐药株的顺铂蓄积量仅为敏感株的 38%～67%,DNA 复合物形成量为敏感株的 10%～38%顺铂耐药株的细胞内基础铜水平较敏感株低 22%～56% ,在暴露于含铜介质 24h 后耐药株细胞内的铜水平仅为敏感株的27%～46%耐药株中顺铂的摄入速度是敏感株的 23%～55% ,而铜的摄入速度耐药株是敏感株的 56%～75%进一步分析显示每种耐药株中均有铜输出泵表达升高故认为卵巢癌中顺铂耐药性与顺铂在细胞内的药理学有关,而顺铂与铜的摄取和外流的变化平行这与顺铂通过介导铜稳态运输介质来进出细胞的概念一致５ 谷胱甘肽 S 转移酶（GSTs）酶性解毒作用增加谷胱甘肽 S 转移酶是一组具有多种生理功能的蛋白质GSTs 亚基类型多种多样，结构也很复杂，其基本的主要生理功能是参与机体解毒研究表明：与肿瘤细胞多药耐药密切相关的 GSTs亚型主要是 GST-、GST-和 GST-，同时不同类型的 GSTs 对不同的抗癌药有一定特异作用GSTs 表达导致肿瘤耐药的可能机理为：①它可催化谷胱甘肽与各种亲电子分子和疏水性分子结合，使其更有极性而加强外排而在常用化疗药中铂类药物都具有亲电子性的特点，因此不可避免地成为 GSTs 的底物，而导致肿瘤细胞内药物外排增加，对肿瘤细胞毒性下降，而出现耐药。
Goto 等［12］的研究发现，通过导入外源性 GST-基因入顺铂敏感的细胞系后，该细胞的 GST- mRNA 表达与对顺铂耐药程度以及细胞内谷胱甘肽顺铂加成物浓度呈正比这为上述理论提供了实验依据②它可通过非酶结合的方式将细胞内的毒性化学药物排除，从而达到解毒的目的Arnstrong 等［13］研究发现，当导入外源性 GST-基因或在诱导癌细胞耐药过程中细胞表达 GST-时，其细胞内的化疗药物特别是铂类药物的贮留量明显减少并出现 MDR 表型包括对铂类药物耐药６ 与谷甘肽（GSH）结合增加谷胱甘肽是机体内的一种非特异性解毒物质对肿瘤细胞免受脂质过氧化酶的破坏起保护作用谷光甘肽的合成依赖于其前身如谷氨酸(Glutamate)的产生,此过程是通过-谷氨酰转肽酶(-glutamyl transpeptidase,GGT)来完成的谷光甘肽是在-谷氨酰半光氨酸合成酶(-glutamyl-cysteine synthetase,GCS)和谷光甘肽合成酶(glutathione synthetase)的催化下而产生的,谷光甘肽合成的第一步是由 GCS 催化的限速反应,此反应可被 buthionine sulfoximine 抑制。
在耐药状态下，肿瘤细胞内的化疗药物与 GSH 结合增加并使其对化疗药物的解毒作用增加或肿瘤细胞内药物外排出增加，对肿瘤细胞的毒性下降主要依据有：①顺铂耐药的卵巢癌细胞中 GSH 的浓度明显高于非耐药者Godwin 等［14］采用顺铂诱导卵巢癌细胞系耐药，发现随着卵巢细胞对顺铂耐药程度的增加，细胞内 GSH 水平也随之增加，顺铂重度耐药的细胞，其GSH 水平较正常细胞增加近 50 倍，顺铂耐药和胞浆内 GSH 水平的相关系数高达 0.96Abe 等［15］的研究也得到类似结果el-akawi 等［16］在采用顺铂诱导 A2780 耐药后，-GTmRNA 表达（2.5～8 倍）以及酶活性（2.7～2.8 倍）增高，而这种表达增高与顺铂的诱导浓度和耐药细胞内 GSH 浓度增高呈正比因此，认为治疗浓度的铂类制剂诱导 A2780 细胞表达，翻译-GT 引起 GSH 增高而产生耐药其三，Goto 等［17］的体外实验中 GST- mRNA 表达、GSH 和 GSH-顺铂加成物增加，细胞内的顺铂浓度下降但 GSH 激活的 Mg++-ATP 酶活性无改变因此，认为 顺铂诱导-GCS 的转录、翻译，进而引起 GSH 水平增高。
７ 细胞外基质Sherman Baust 等［18］发现在顺铂耐药的卵巢癌细胞中多种细胞外基质的基因功能上调,其中 COL6A3 上调最明显顺铂敏感细胞在有胶原Ⅵ存在情况下培养可增加细胞对顺铂的耐药性随后证实卵巢肿瘤中的确存在胶原Ⅵ,而且胶原Ⅵ与肿瘤分级有关,表明肿瘤附近的细胞外基质进行了重新组织结果提示。