溶剂萃取法提取蓝莓中花色苷 冷吉燕 袁彤 王叶宝 张婧 王继萍* 王赞* （吉林大学白求恩第一医院，长春 130021）摘 要 建立蓝莓花色苷的溶剂萃取方法酸性乙醇二次粗提蓝莓，经AB-8大孔树脂纯化，真空干燥箱干燥，用红外光谱法、紫外可见光谱法、Fecl3显色反应、中性醋酸铅反应提取物进行组分检测，PH示差法计算总花色苷含量，用公式色价=吸光度×测定吸光度时所吸取样品的稀释倍数/样品的质量(g) 计算色价结果：红外光谱法、紫外可见光谱法、Fecl3显色反应、中性醋酸铅反应可证明提取物为黄酮类物质，提取物含量为2.29mg/g,色价为36关键词 溶剂萃取；蓝莓花色苷；AB-8大孔树脂1 引言蓝莓( blueberry) ,又称越橘、蓝浆果,属杜鹃花科( Ericaceae) 越橘属(Vaccinium1spp)多年生落叶或常绿灌木蓝莓果实呈深蓝色，被白霜,近圆形,含有丰富的花色苷, 花色苷是花色素与糖以糖苷键结合而成的黄酮多酚类化合物结构性质稳定，花色素的基本结构为3, 5, 7-三羟基-2-苯基苯并吡喃, 由于苯环中取代基、羟基和甲氧基位置和数量不同,衍生出不同的配糖体化合物。
在花色素A环上的羟基以糖苷键与糖结合便形成花色苷蓝莓花色苷具有抗氧化、清除自由基、降血脂、抗炎、改善胰岛素抵抗、保护内皮细胞及抗肿瘤等多种生物学功能[1-5]国内外对蓝莓花色苷的研究主要集中在生理功能和稳定性方面，而对蓝莓花色苷的提取研究较少为探索更佳的提取工艺,提高花色苷的提取率,本文由吉林省科技厅重点项目（No.20110935）资助* Email:wangjipin2008@笔者采用酸性乙醇对蓝莓花色苷进行了提取，并用AB-8大孔树脂纯化，以便为以后的工业化生产提供理论依据2 实验部分2.1 仪器与试剂B4-095型分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；循环水式真空泵（巩义市英峪仪器厂）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（上海豫康科教仪器设备有限公司）；OSB-2100型EYELA油浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；N-1100型EYELA旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；DZF-6200型真空干燥箱（上海精密实验设备有限公司）；50CONC型紫外扫描仪（美国瓦利安公司）；PHS-25酸度计（上海里达仪器厂）蓝莓；AB-8大孔树脂（天津南开大学化工厂）；乙醇、盐酸（分析纯）；氢氧化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、三氯化铁、醋酸铅（北京化工厂）2.2实验方法2.2.1粗提 取一定量蓝莓果,破碎,用pH = 3的60%乙醇溶液40℃浸提2小时后抽滤,收集滤液,利用蓝莓果残渣再次于相同条件下重复实验1次，将2次的滤液于40℃下减压浓缩,得到红色粘稠的粗提液。
2.2.2 纯化 将花色苷粗提液用PH=3的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释成3g/ml，加入AB8树脂柱，充分吸附超纯水冲洗，洗去杂质控制流速，流速约为1ml/min，用60%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液2.2.3真空干燥 将洗脱液至于真空干燥箱中干燥，得紫黑色提取物2.2.4自制花色苷提取物组成分析2.2.4.1 三氯化铁（Fecl3）显色反应 取少量提取物用乙醇溶解，滴加1%Fecl3溶液数滴，震荡后观察颜色变化2.2.4.2中性醋酸铅反应 向1mg/ml提取物溶液中加入中性醋酸铅，观察颜色变化2.2.4.3 紫外-可见光谱分析 取少量提取物溶于60%乙醇与PH=3的柠檬酸-柠檬酸钠溶液中，测紫外吸光值分别把蓝莓花色苷样品用pH 1.0的酸性水溶液和体积分数0.1%盐酸甲醇溶液溶解,用紫外可见分光光度计进行光谱扫描,得到蓝莓花色苷的紫外的可见光谱图在蓝莓花色苷甲醇溶液分别加AlCl3、CH3ONa,进行光谱扫描,并与蓝莓花色苷甲醇溶液中吸收光谱比较2.2.4.4 红外光谱法分析提取物的化学基团组成 取少量样品置于玛瑙研钵中,再加适量溴化钾粉末,研磨,放入压片模具中,加压, 3 分钟后取出样品,放入仪器的样品槽中,用红外光谱仪上作傅立叶变换红外光谱扫描,得到化合物的红外光谱图。
2.2.5自制花色苷提取物色价及含量2.2.5.1色价 精确称取自制的花色苷提取物0.05g ,用pH3.0的柠檬酸缓冲液定容至100mL容量瓶中,稀释至一定倍数,在520nm处测定其吸光值,用公式色价= A ×r/ W 计算色价,式中A为吸光度,W为样品的质量(g),r 为测定吸光度时所吸取样品的稀释倍数2.2.5.2 花色苷总含量的测定 通过波长扫描,用PH示差法计算溶液中总花色苷含量,计算公式如下:C (mg/ g) = (A0 - A1 ) ×V ×n ×M / (ε×m) (湿重)式中:A0 、A1 —分别为pH1.0、pH4.5时花色苷在520nm处的吸光值; V—提取液总体积(mL) ; n—稀释倍数;M—cy- 3- glu (矢车菊- 3-葡萄糖苷)的相对分子质量(449) ;ε—cy- 3 - glu的消光系数(29600) ;m—样品质量(g)3 结果与讨论3.1自制花色苷提取物组成分析3.1.1 Fecl3显色反应 提取物经乙醇溶解后，滴加1%Fecl3溶液数滴，震荡后溶液变成深褐色，表明其具有酚羟基的特征反应3.1.2中性醋酸铅反应 向1mg/ml蓝莓提取物中加入中性醋酸铅，立即产生蓝白色沉淀，随着铅离子浓度的增加沉淀逐渐增多，表明提取物中含有酚基。
因为酚基是黄酮类化合物的官能团之一，因此可以判断蓝莓花色苷属于黄酮花色苷类色素3.1.3紫外-可见光谱分析 测得提取物在60%乙醇与PH=3的柠檬酸-柠檬酸钠溶中于536nm与524nm存在一吸光值最高峰，该最高峰为花色苷的特征峰蓝莓花色苷在酸性水溶液中的吸收峰分别在279、520 nm处,在甲醇溶液中的吸收峰分别在284、537 nm处花色苷最大吸收波长一个在可见光区的500 - 540nm附近,另一个在紫外275 nm附近,由此可以判断蓝莓色素属于花色苷类色素在300 - 330 nm处有小的吸收峰,说明蓝莓花色苷中有酰化的花色苷向蓝莓花色苷的甲醇溶液中加AlCl3、CH3ONa后,可见区的最大吸收峰向长波方向移动,说明含有B2环有邻位酚羟基的花色苷3.1.4 红外光谱法分析圣云蓝莓花色苷中的化学基团组成对蓝莓提取物进行红外检测，测得于3424.1cm-1 、2932.673 cm-1、1381.954 cm-1、1637.514 cm-1、1197.758 cm-1、1457.078 cm-1处存在吸收峰3424.1cm-1处存在吸收峰表示提取物羟基的伸缩活动；2932.673 cm-1处吸收峰则为甲氧基C-H面内弯曲振动峰；1637.514 cm-1可能为C=O键伸缩振动的吸收峰；1197.758 cm-1可能是芳烃骨架C=C键伸缩振动吸收峰；1457.078 cm-1表示C-O-C伸缩振动吸收峰。
以上的吸收峰均为花色苷的吸收峰，因此可以表明蓝莓中存在羟基、甲氧基、含氧杂环、苯环等特征集团，而这些集团也为黄酮类化合物的特征集团，故蓝莓花色苷属于黄酮类物质3.2自制花色苷提取物色价及含量提取物色价为36，含量为2.29mg/g4 小结蓝莓中花色苷含量丰富, 以及花色苷具有较高的开发与利用价值,溶剂萃取法投资少，设备简单，为以后的工业化生产提供理论依据Reference1.Chang YC，Huang KX，Huang AC，et al.Hibiscus anthocyanins-rich extract inhibited LDL oxidation and oxLDL—mediated macrophages apoptosis．Food Chem Toxicol，2006，44：1015-1023．2.牟海英、屈琪,刘静，等.花色苷对高脂血症人群血脂及体内氧化应激水平的影响.营养学报,2010 ,32 (6), 551～555.3. Kudolo GB. The effect of 3-month ingestion of Ginkgo biloba extract( EGb 761) on pancreatic beta-cell function in response to glucose loading in individuals with non-insulin-dependent diabetes mellitus[ J ]. J Clin Pharmacol, 2001, 41 (6) : 600 - 611.4.Kudolo GB, Wang W, Barrientos J, etal， The ingestion of Ginkgo biloba extract ( EGb 761) inhibits arachidonic acid-mediated platelet aggregation and thromboxane B2 production in healthy volunteers[ J ].J Herb Pharmacother, 2004, 4 (4) : 13 – 26.5. Imanishi T, Hano T, Sawamura T et al. Oxidized low-density lipoprotein induces endothelial progenitor cell senescence, leading to cellular dysfunction[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol,2004,31；407-413. Solvent extraction blueberry anthocyaninsLENG Ji-Yan,YUAN Tong,WANG Ye-Bao,ZHANG Jing,WANG Ji-Pin*,WANG Zan* ( The First Hospital of Jilin University , Changchun 130021)Abstract The establishment of blueberry anthocyanins of solvent extraction method. Use acid ethanol secondary coarse extraction blueberries, after the AB-8 macroporous resin purification, vacuum drying oven drying, infrared spectrometry, uv-vis method, Fecl3 color reaction and neutral acetic acid lead reaction extracts to test components, use PH differential method to calculate the total content of anthocyanins, via the equation: produce = absorbency × the diluted times of determination spectrophotometry from samples /the quality (g) to get the calculation. Results: the infrared spectrometry, uv-vis method, Fecl3 color reaction, the reaction of neutral acetic ac。