实验十一 产蛋白酶芽孢杆菌的分离（一）———芽孢杆菌的分离一、目的和要求1. 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的筛选方法2. 学习和掌握芽孢杆菌的分离技术二、实验原理芽孢杆菌于芽孢具有较强的抗高温能力， 分离纯化时可采用热处理的方法， 即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种， 使耐热的芽孢菌得到富集 许多芽孢杆菌能分泌分泌蛋白酶，淀粉酶， 可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基， 因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈根据透明圈直径 （H）和菌落直径（C）之比值（H/C） 可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株 三、实验器材1. 土壤样品：从地表下 10~15cm 的土壤或者枯枝烂叶，腐烂稻草中用无菌小铲，纸袋取土样，并记录取样的地理位置、 pH 、植被情况等 （学生自取 ）家畜饲养、屠宰等动物性蛋白丰富的地点土壤中筛选高产蛋白酶菌株的概率更大， 若条件许可， 建议尽量选择这样的地 点进行采样2. 牛肉膏蛋白胨培养基（ 1000ml, 配制时， 只加 800ml ，每个三角瓶分装 180ml ） ， 15%脱脂奶粉溶液（脱脂奶粉用水溶解后应单独灭菌（ 0.06MPa,30min ） ， 铺平板前与加热溶化 的肉汤蛋白胨培养基混合） ，盛 9ml 无菌水的试管，盛 90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒、 1ml 吸管（ 4 支） ， 10ml 吸管（ 1 支）和培养皿（ 10套） ，接种环等。
3. 水浴锅四、操作步骤1. 牛奶平板制备 （ 4 人 / 组）牛肉膏蛋白月东培养基（180ml）融化，待冷至55—60C时，添加20ml无菌15%脱脂奶粉溶液混合均匀，配制终浓度为 1.5%的牛奶牛肉膏蛋白胨培养基；到平板2. 土壤样品的处理将采集的土壤样品做成菌悬液（10-2）后置于80 c水浴中加热10〜20分钟以杀死不能 形成芽孢的菌体3. 稀释涂布分离法（ 1）制备样品稀释液 称取 10 克土壤，放入盛 90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约 20 分钟用一支 1ml 无菌吸管从中吸取 1ml 土壤悬液，注入盛有 9ml 无菌水的试管中，吹吸 3 次，使其充分混匀加热杀死不能形成芽孢的菌体然后再用一支 1ml 无菌吸管从此试管中吸取 1ml 注入另一盛有 9ml 无菌水的试管中，以此类推制成 10-2、 10-3、10-4 各种稀释度的土壤悬液溶液 （3）涂布 将平板底面分别写好 10-2、 10-3、 10 -4三种稀释度，然后用无菌吸管分别从10-4、 10-3、 10-2三管土壤稀释液中各吸取 0.2ml 对号放入平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
（ 4）培养 将平皿倒置 37 ℃培养 30 小时左右五、实验报告1. 初步获得的 H/C 比值大，产蛋白酶活力高的芽孢杆菌菌株实验十二 产蛋白酶芽胞杆菌的分离筛选（二） 产蛋白酶芽抱杆菌的筛选与初步鉴定一、目的和要求1 . 了解并掌握产蛋白酶菌株的筛选模型2 .掌握芽抱有无的鉴定方法3 .进一步掌握划线分离得到纯种菌株的方法 二、实验原理许多芽抱杆菌能分泌分泌蛋白酶， 淀粉酶，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈 根据透明圈直径（H）和菌落直径（C）之比值（H/C）可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高， 进而可筛选出高产酶活的菌株细菌简单染色、芽抱染色、划线分离原理见先前实验 三、实验器材1.牛奶平板2.显微镜、简单染色和芽抱染色试剂等3.培养箱四、操作步骤：1、产蛋白酶菌株的观察对牛奶平板上的总菌数和产蛋白酶的菌数进行记录， 选择蛋白酶水解圈最大的 4个菌株进行编号，用米尺分别测量、记录菌落和透明圈的直径观察菌落特征2、划线分离纯化菌株（上次实验任务）将上述初步分离的芽胞杆菌在牛奶平板上划线分离培养，分离纯化，得到单菌落。
3、牛奶平板制备透明圈大小测定进一步观察牛奶平板透明圈，测定透明圈直径 （H）和菌落直径（C）之比值（H/C）4、简单染色选最大透明圈的菌株进行简单染色观察细胞形态5、芽抱染色选最大透明圈的菌株进行芽抱染色观察芽抱形成情况6、菌种保藏将实验分离得到的高产蛋白酶芽胞杆菌接种保藏在牛肉膏蛋白月东试管中， 作为后续实验的菌种使用五、实验报告1.绘制菌体形态图，给筛选到的高产蛋白酶芽抱杆菌做一个初步鉴定报告实验十三 酵母菌的筛选及其糖发酵试验研究（一）——酵母菌的富集培养与分离一、目的和要求学会从自然界各种基质中富集和分离酵母菌的方法二、实验原理自然界中的土壤、水果、酒曲等基质中含有大量的微生物，其中有霉菌、酵母和细菌，酵母菌的数量一般不占优势， 直接分离酵母菌往往不易成功 在液体中，酵母菌生长比霉菌快；而酸性培养基中酵母菌比细菌生长更适宜因此，可以利用这二个特性，用酸性液体培 养基对所分离的样品进行加富培养，使酵母菌数量占优势然后用稀释平板分离法或划线分离 法分离酵母菌，获得酵母菌的纯培养物三、实验器材1 .分离材料：采集种植蔬菜的土壤、果园土壤，或酒曲、葡萄等水果样品由各小组自 备2 .培养基：豆芽汁培养基（附录三、 3）。
3 .器材：无菌平板、无菌吸管、无菌水等四、操作步骤1 .配制培养基：（4人/组）（1）酵母菌富集培养基：酸性蔗糖豆芽汁（加乳酸 0.5%）培养液分装大试管，灭菌4支/组）（2）蔗糖豆芽汁琼脂，分装三角瓶，灭菌（ 10皿/4人）2 .分离：（1）富集培养：取少许待分离的样品投入酸性豆芽汁培养液中，摇动后将该试管置25-28 C培养箱中培养，2天后取1mL菌悬液转接到另一管酸性培养液中培养 2天，取样制水浸片镜检观察到有酵母菌时，进行酵母菌分离2）酵母菌分离：采用稀释平板分离法 根据样品中酵母菌的数量决定样品的稀释度， 一般取10-2、10-3、10-4稀释度涂布蔗糖豆芽汁琼脂平板 28 c培养2-3天获得单菌落3）酵母菌鉴定及菌种培养与保存：尽量选取菌落形态有差异的菌落，取少许单菌落的菌体制片镜检个体形态为酵母菌，将该单菌落的其余菌体转接划线至蔗糖豆芽汁琼脂平板，28 c培养2天保存备用，并对菌株进行编号五、实验报告：实验十四 酵母菌的筛选及其糖发酵试验研究（二）——酵母产酒精能力测定试验一、目的和要求筛选产酒精的酵母菌株二、实验原理红四氮陛，全称2, 3, 5-氯化三苯基四氮陛，简写 TTC,它是一种显色指示剂，原是无色 的，由于活菌中所含脱氢酶可将它还原成红色， 使平板上原先看不太清楚的微小菌落染成肉眼清晰可见的红色菌落，且通过它呈色的深浅可判断酵母产酒精能力的高低， 产酒精能力强的酵母会显现深红色，次之显粉红色、微红色或不显色。
三、实验器材1 .实验菌株：各小组分离的酵母菌株2 .培养基：TTC下层培养基：葡萄糖10g,蛋白脐2g,酵母粉1.5g ,KH2PO4lg,MgSO4.7H2O 0.4g,水1000mL琼脂30g, pH5.7-6.0,115 C灭菌10分钟培养基中应该要加入的 TTC 的量）TTC上层培养基：葡萄糖 0.5g/L, 琼脂1.5g/L , TTC0.05g/L 四、操作步骤：1,配制培养基：TTC培养基，4皿/组3 .划线分离接种：取酵母菌进行划线分离接种， 28c培养24h,观察单菌落颜色深浅，初步判断菌株产酒精能力 五、实验报告实验十五 酵母菌的筛选及其糖发酵试验研究（三）——酵母菌的发酵糖类试验一、目的和要求这些实验用来鉴定每一株酵母菌在好养生长下利用某种化合物的能力 二、实验原理在许多酵母菌种之间通过它们对利用某种有机化合物作为单一主要碳源的能力差异， 来进行区别是可行的，这些化合物包括糖类、糖醇、和有机酸类 三、实验器材1 .酵母菌氮源基础培养基： 硫酸俊1 g,磷酸二氢钾0. 5 g,硫酸镁0. 2 g,酵母粉0. 1 g , 琼脂20g,水1000mL全班统一配 1000mL）2 .糖类利用培养基：在基础培养基中分别添加 1%的蔗糖（ck）,木糖，半乳糖，山梨糖，分装后，115c灭菌10分钟。
每种培养基配250mL/班，每组4种培养基，每人1皿四、操作步骤1 .最常用的两种试验方法是液体培养基试管法与生长谱法生长谱法：将酵母菌接种到 除碳源外，含有一切生长需要的琼脂培养基上 将不同的待测化合物有规则地放置在该培养基的表面2 .本实验采用简化的生长谱固体平板培养法划线接种不同菌株于上述培养基中， 28 C培养48h,观察酵母菌生长情况木糖平板五、实验报告:。