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1、浙江红雨医药用品有限公司浙江红雨医药用品有限公司无菌检验方法验证方案及报告 验证方案申请人: 日期: 年 月 日验证方案审核人: 日期: 年 月 日验证方案审批人: 日期: 年 月 日1 概述 无菌检查法是为了检查药典要求无菌的医疗器械产品是否无菌而建立的检查法， 是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性 ， 液体培养基变浑浊一般表明样品受微生物的污染。基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约， 如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。检验方法的验
2、证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分 ，是保证检验结果的公正、 科学、准确的基础 。 2 验证目的 对本公司所采用的直接接种无菌检查法进行分析验证，以证明所采用的方法适合于本公司产品的无菌检查。3 实验原理 直接接种法是通过加入一定的抑菌中和剂，以方便而快捷地中和抑菌剂，消除抑菌作用，从而消除抑菌作用对无菌检查的影响。 本实验通过设计对照试验对直接接种法所加入的抑菌剂的中和效果进行验证，从而得出直接接种法无菌检验的有效性。4 验证范围实用于本公司所采用的直接接种法进行的无菌检验过程验证。5 执行程序文件编码文件名称存放部门HY-QC-012无菌检验操作
3、规程品管部 6 职责 姓名职务职责 刘传杰经理负责验证方案的批准实施、验证报告的批准周德标QC验证方案、验证报告的起草并负责验证过程中现场的监控及取样张思东QC负责按制订无菌检验规程实施检验和验证实验7 验证内容 建立样品组、对照组及菌种活性检查组，接种菌株到指定培养基，培养2472小时，比较观察菌落的生长状况，得出结论。8 验证指示物本实验所用菌种为购于 浙江省食品药品检验研究所 标准菌株:金黄色葡萄球菌、白色念球菌、大肠埃希菌及生孢梭菌。9 实验过程 （1）培养基的配制 用于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的营养琼脂培养基 用于白色念球菌的改良马丁培养基 用于生孢梭菌的流体硫乙醇酸盐培养基 （2
4、）供试品的制备 创可贴供试品：将包装好的创可贴打开，用剪刀将创可贴剪碎，放入100ml pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中浸泡1小时，取水层作为供试品。 无菌敷贴供试品：将包装好的无菌敷贴打开，用剪刀将无菌敷贴剪碎，放入100mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中浸泡1小时，取水层作为供试品。（3）供试菌液的制备 大肠埃希菌菌液：取经35培养19小时的大肠埃希菌培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至约10-510-8之间,混匀备用。 金黄色葡萄球菌菌液：取经35培养19h小时的金黄色葡萄球菌培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至约0-510-8之间,混匀备用。 白色念球菌菌液：取经25.5
5、培养72小时的白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取1ml加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，取1.2ml加生理盐水9ml，混匀备用。 生孢梭菌菌液：取经35培养18h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，混匀备用。 （3）实验设计实验样品组：按照本公司常规微生物检验方法进行，加入抑菌中和剂，最后接入已知量的菌株（100cfu），培养观察。阳性对照组：以0.1%的蛋白胨代替供试品，加入抑菌中和剂，最后接入同样量的菌株，培养观察。阴性对照组：取与实验样品组等量的供试品，加入与中和剂等量的生理盐水，最后接
6、入已知量的菌株（100cfu），培养观察菌种活性检查组：直接将菌种接种到培养基上，培养观察。10 标准与判断 1. 如果实验样品组与阳性对照组的微生物计数相似，表明所用中和剂（中和剂类别及用量）具有足够的中和效力； 2. 如果阳性对照组与菌种活性检查组的微生物生长数量相似，表明所用的中和剂不影响微生物的生长。 3. 阴性对照组微生物生长量应低于实验组，才能证明供试剂有抑菌性，否则该实验无意义。 4. 样品组的平均菌检计数结果不得低于对照组的70%，否则直接否定无菌检验方法。11 检验与记录无菌检查验证实验数据表（菌落数/皿）NO: 供试品： 实验时间： 试验组名 检验菌种实验样品组阳性对照组阴
7、性对照组活性检查组 大肠埃希菌12345平均 金黄色葡萄球菌12345平均白色念球菌12345平均生孢梭菌12345平均结论： 实验人： 日 期： 年 月 日 复核人： 日 期： 年 月 日12 编写验证报告（1）根据验证方案设计实验； （2）统计实验数据编写验证报告。13 再验证周期及日常监测 （1）无菌检查按所生产的每批次进行日常监测； （2）当无菌检查日常监测出现不符合标准时，必须进行再验证； （3）当无菌检查方法发生改变和生产工艺发生改变时，必须重新验证； （4）本验证方案有效期为1年。14 验证结果与评价 实验人对验证实验结果做好相关记录并进行科学性评价；15 验证方案的批准 验证小
8、组审阅所有结果及评价分析意见，同意验证结果，签字并按此结论实施。直接接种无菌检查法验证报告一 实验目的 对本公司所采用的直接接种无菌检查法进行分析验证，以证明所采用的方法适合于本公司产品的无菌检查。二 实验原理 直接接种法是通过加入一定的抑菌中和剂，以方便而快捷地中和抑菌剂，消除抑菌作用，从而消除抑菌作用对无菌检查的影响。 本实验通过设计对照试验对直接接种法所加入的抑菌剂的中和效果进行验证，从而得出直接接种法无菌检验的有效性。三 实验步骤1、.培养基的配制 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌用的营养琼脂培养基：准确称取营养琼脂培养基16.5g，加入500ml纯化水，缓慢加热使其完全溶解。 白色念球菌用
9、的改良马丁培养基：准确称取改良马丁培养基14.5g，加入500ml纯化水，在加入6g琼脂粉，加热使其溶解。生孢梭菌用的流体硫乙醇酸盐培养基：准确称取流体硫乙醇酸盐培养基14.5g，加入500ml纯化水，在加入6g琼脂粉，加热使其溶解。 将上述配制好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅中115，30min。2、供试品的制备 创可贴供试品：将包装好的创可贴打开，用剪刀将创可贴剪碎，放入100ml pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中浸泡1小时，取水层作为供试品。 无菌敷贴供试品：将包装好的无菌敷贴打开，用剪刀将无菌敷贴剪碎，放入100ml pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中浸泡1小时，取水层作为供试品。 3、供试菌液
10、的制备：大肠埃希菌菌液：取经35培养19小时的大肠埃希菌培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至约10-510-8之间,混匀备用。金黄色葡萄球菌菌液：取经35培养19h小时的金黄色葡萄球菌培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至约10-510-8之间,混匀备用。白色念球菌菌液：取经25.5培养72小时的白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取1ml加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，混匀备用。生孢梭菌菌液：取经35培养18h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，混匀备用。4 、分别取上述两种供试
11、品100ml，加入抑菌中和剂，接入100cfu菌株（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌及生孢梭菌分别进行实验），再接种到每种菌株所需的上述培养基中，作为实验样品组。5 、用0.1%的蛋白胨溶液代替供试品进行同上步骤操作，作为实验阳性对照组。6、取与实验样品组等量的供试品，加入与中和剂等量的生理盐水，再同第4步操作，作为阴性对照组。7、 取100ml 0.1%蛋白胨溶液，不加中和剂直接接种等量菌株，再接种到培养基上，作为菌种活性检查组。8 、将接种好的培养皿放入恒温培养箱中，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及生孢梭菌培养温度为35，白色念球菌培养温度为25.5，培养数天后，观察并记录菌落数。四 实验结果记录无菌检查验证实验数据表（菌落数/皿）NO:1 供试品：创可贴 实验时间： 试验组名 检验菌种实验样品组阳性对照组阴性对照组活性检查组 大肠埃希菌12345平均 金黄色葡萄球菌12345平均白色念球菌12345平均生孢梭菌12345平均结论： 实验人： 日 期： 年 月 日 复核人：
