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1、 小麦玉米远缘杂交诱导小麦单倍体的研究进展前言运用传统的育种方式对小麦品种进行基因改良，按照小麦品种选育的常规育种程序，一般需要5-8年才能筛选出纯合的系(种)形成农艺性状相对整齐一致的稳定群体。再进行多点试验评估育种材料的适应性和商业价值，造成育种周期长、资源消耗大、延误品种的培育的严重后果1，且自交后的纯合品系仍包含一些杂合基因的缺陷。若引入远缘种质，由于杂F2及后代疯狂分离，使品种纯化需要更长的时间2。近年来随着分子生物学技术的发展及单倍体育种等手段极大提高了育种的精确性和育种效率。为了解决育种周期长的突出问题，小麦遗传育种工作者利用小麦与玉米杂交后，杂合子代体细胞中父方染色体消失3，获
2、得大量的小麦单倍体植株，再进而经过染色体加倍。通常双单倍体在一个世代中就可以得到完全纯合的重组体4。利用小麦单倍体的加倍创建纯合双单倍体(Double haploid，DH)系，对缩短小麦育种年限，加快育种进程，提高选择效率及遗传研究等具有重要意义5。由于单倍体育种手段尚不成熟，国内外经常出现小麦远缘杂交单倍体胚、单倍体苗的产生频率以及染色体加倍效率不稳定，加倍单倍体植株成功率相对较低的报道6。国内外科学家正致力于小麦玉米远缘杂交单倍体诱导育种技术的研究和完善，希望在较短的时间周期内培育出优质、高产、广适的小麦品种。1 小麦单倍体产生和鉴别1.1 小麦玉米杂交系产生单倍体培养途径如花药/花粉粒
3、培养、子房/胚珠培养、远缘杂交单倍体诱导已逐渐进入品种改良迅速发展时期。目前已有200多种植物通过花粉/花药培养获得了单倍体植株，其中以茄科和禾本科居多7许多禾本科作物通过花粉/花药培养诱导植株再生已经获得成功，如水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦和高粱。大麦、玉米、水稻和小麦通过培养子房和胚珠使单倍体再生8的研究也有了很大的发展。但上述两种方法应用于普通小麦时出现成苗率低和大量白化苗的现象。1964年，Guha和Maheshwari从曼陀罗花粉中第一次培育出单倍体植株。1975年Barelay9用普通小麦与球茎大麦杂交获得了高频率的小麦单倍体，但后来的研究表明由于小麦5B染色体长臂上的Kr1基因和
4、5A染色体长臂上的Kr2基因阻止小麦与异源植物交配，造成普通小麦与球茎大麦之间的杂交存在不亲和性10。Zenkteler11最早报道了六倍体普通小麦与玉米之间的远缘杂交。1986年Laurie等12利用小麦玉米成功诱导出小麦单倍体植株，并通过细胞学观察证实了小麦玉米得到的幼胚是单倍体胚，小麦授玉米花粉1d后的杂种胚存在21条体积较大的小麦染色体和l0条体积较小的玉米染色体，授粉3-6d的杂种胚中仅有2l条小麦染色体和微核。在最初的3次细胞分裂中，来自父本玉米的染色体被完全排除掉，形成了仅有21条母本小麦染色体的单倍体胚。利用小麦品种间代换系进行进一步比较，小麦玉米的受精频率不受小麦所携带的Kr
5、1和Kr2基因的影响，Kr基因在小麦与玉米杂交中是不敏感的。Zhang J等13比较分析了小麦玉米杂交与自花授粉的小麦植株的胚胎石蜡切片发现胚乳极核留在细胞质中没有发育到细胞阶段,便逐渐退化。Mochida等14观察证实了小麦杂交24-28h后受精卵细胞分裂后玉米的染色体迅速消失的情况。1.2小麦单倍体的方法和鉴别小麦单倍体主要有三种方法：花药培养法、球茎大麦法和玉米杂交法。花药培养法因受小麦基因型限制导致成苗率较低，以及因产生大量白化苗而限制了应用。球茎大麦法中位于小麦5B、5A染色体上的Kr基因对小麦基因型存在明显的选择性，提高了外源植物与之交配的难度。而且小麦与球茎大麦杂交后，球茎大麦染
6、色体并不完全消失，来自父本的某些不利基因的进入受体小麦中。利用小麦与玉米远缘杂交诱导小麦双单倍体主要依赖于单倍体胚产生频率、单倍体植株的获得频率以及单倍体植株的加倍成功率。由于原胚的分裂和2,4-D的作用获得了小麦单倍体胚方法的广适性更好。通过解剖开外种皮后，白色的胚漂浮在种皮包被的水囊里，而胚乳极核留在细胞质中没有发育到细胞阶段，形成缺乏胚乳的种子是鉴别小麦多元单倍体胚的基本特征15。鉴定小麦(Triticum aestivum L.)玉米(Zea mays L.)产生的杂种子代的单倍性，采用形态学和细胞学鉴定相结合的方法发现杂种子房内均无胚乳，仅在少数子房内观察到1个游离的球形幼胚且发育成
7、植株后在花期花药退化或花粉败育16，可作为杂交后代单倍性的形态学标记。2.1转化率影响因素2.1 亲本的选配小麦和玉米基因型对多元单倍体胚形成到小苗再生具有显著的影响。Suenaga17,18等评估来自不同地理区域(亚洲、欧洲、北美和澳大利亚)的47个小麦基因型55个玉米品种(品系)，其产生胚的能力上存在显著的基因型差异。研究结果显示不同组合的单倍体胚平均形成率是15.2%，但胚形成率变化幅度相当大(以色列低聚糖麦秆的形成率为0.9%，日本Hiyoku-komugi的形成率为35.8%)。2.1.1 小麦基因型Inagaki等19认为不同小麦基因型的单倍体得胚率存在明显差异，Kisan N.S
8、.等20、陈新民等21认为不同小麦基因型对单倍体得胚率无显著影响。蔡华等2用100多个小麦F1代组合与玉米杂交结果显示不同基因型小麦对得胚率存在显著差异,最高单倍体得胚率达3O%以上，最低在5%以下。小麦基因型之间的差异对杂交诱导的影响最为重要。张新玲等22验证得玉米花粉诱导六倍体普通小麦得胚率为5.4%，明显高于四倍体。杀配子染色体杂种材料与玉米的杂种成胚率有待研究。利用杀配子染色体材料的杂交后代不同基因型小麦材料(母本)与滇超甜2号玉米(父本)杂交杂种成胚率无显著差异23。 2.1.2 玉米基因型相比小麦基因型，玉米基因型操纵主动性更强，良好的玉米基因型明显提高诱导单倍体得胚率。不同基因型
9、花药诱导愈伤组织的诱导率差异很大24。陈新民等5用三个玉米单交种给同一小麦品种授粉，结果得胚率在13.3-33.1%，且各处理组合间存在显著差异。蔡华等2用35个小麦F1代组合与4个不同玉米基因型进行杂交，结果也很明显。同时，王广金25用甜玉米，糯玉米，普通玉米三种基因型和两个小麦杂交组合进行试验，得到平均得胚率为甜玉米(8.71%)糯玉米(6.54%)普通玉米(5.65%)。所以发掘和选择具有高受精率、易成胚的玉米基因型是研究中的关键环节。2.2 生长环境自然生长环境条件对得胚率影响最大的因素是温度和光照。Campbell等26研究结果显示对单倍体诱导的最佳温度为白天22夜晚17；最佳光强为
10、1000mol-1.m.s.PAR，16h/d。因此，控制授粉后15d左右的光温条件对于幼胚的生长发育非常重要。光照是影响得胚率的重要因素，连续阴雨造成的极端寡照显著降低小麦单倍体胚的得胚率27。此外，小麦的生长环境的湿度、生长期间的水肥及植株生理状态也会影响到单倍体得胚率和出苗率。在低湿度状态下平均生产的颖果数和胚数是高湿度状态下的2倍，而且单倍体株数较多，因为低湿度状态下胚细菌感染率仅为5%远小于高湿度状态下的50%28。 在最适宜培养条件下，室内离体培养法平均成胚率(23.6%)高于常规杂交法(18.1%)，且以2O、光照3000Lx、12h/d、相对湿度7O%条件下离体培养杂交穗14d
11、获得的成胚率最高(28.6%)，授粉后获得最高成胚率的T1O有效积温在187.9-254.9之间29。一定的积温对于诱导成功率有促进作用。2.3 花粉活力玉米和小麦花期相遇是利用小麦玉米诱导小麦单倍体、进行小麦育种的前提30。正常生育条件下两者生长状况差异巨大。冬春季适合小麦生长，玉米一般植株矮小，花粉量少，育性差；而在的夏秋季节，玉米生长旺盛，小麦常因春化条件及环境因素使得植株整体农艺性状不佳，授粉状态不理想。生产上常采用分期播种并配合适当的设施条件以及加强肥水管理等方法来调节花期，促使植株健壮，提高花粉活力，并可对玉米进行温床育苗、大田移栽。蔡东明等30对陕西关中地区冬小麦与玉米杂交的花期
12、调节进行了研究，认为1月27日至2月7日室内营养钵分期点播，3月l日移栽至大棚，在小麦花期便可获得持续的、多类型玉米花粉，确保杂交顺利进行。供体花粉的活力及受体柱头识别、接受异源花粉的能力决定杂交的最终成败。王艳哲等31发现常温条件下玉米花粉具有授精能力，高温(32-35)条件花粉失水干枯，生活力很容易丧失，并且抑制高温花粉的萌发和花粉管生长，导致花粉败育。3 高效规范的实验技术3.1 玉米花粉授粉技术嫩龄授粉与重复授粉是提高远缘杂交结实率，克服小麦远缘杂交不亲和性的有效措施。根据众多学者关于小麦玉米杂交诱导单倍体技术试验结果论述21， 32，最适宜的授粉时间是在小麦开花前1-2d当柱头顶部略
13、分叉呈毛茸状时进行。玉米花粉对小麦的授精能力随花期的延长而降低，晴天上午9：0010：00采集新鲜玉米花粉给去雄的小麦穗授粉，活力最高、效果良好。混合玉米花粉诱导小麦单倍体得胚率4.6%,高于单一玉米花粉22。24h后重复授粉可以使不同穗位的小花也能在适宜时期接受玉米花粉、增强柱头接受异源花粉的能力2。因为小麦玉米花期不遇，可将花粉暂时保存。新鲜的玉米花粉可在l-5低温干燥环境中储存2-3天不影响其授粉效果31；干燥处理后在-80条件下低温可较长时间储藏玉米花粉并可成功地为小麦花授粉，但胚形成率比新鲜花粉低。Paula Filomena等33认为小穗中部进行小麦和玉米的属间杂交能提高所获得的加
14、倍单倍体品系的频率。王霖等34使用小麦不育系处理在单倍体幼胚数、得胚率、双倍体苗数、双倍体幼苗占授粉小花数的百分率指标上都明显高于人工去雄的处理。玉米花粉诱导雄性不育系的得胚率为3.2% ，高于常规材料22，应探索高效适宜的雄性不育材料。3.2 诱导技术3.2.1 2,4-D最适浓度胚乳败育或异常退化，使得杂种幼胚在生长发育的早期得不到胚乳的营养供应而在植株上天亡。为减轻这种危害，完成小麦授玉米花粉后必须用激素处理以促进细胞分裂和发育、诱导小麦单倍体胚形成。孙敬三等35认为2,4-D能明显促进无胚乳的单受精胚胎的生长发育，可有效延长幼胚在植株上的发育时间，从而获得大量可供培养的幼胚。Suena
15、ga18研究了不同类型、不同浓度激素(包括2,4-D、NAA、IAA、BA、KT、ZT、GA3、ABA)的处理效果，发现在小麦最上茎节注射100mg/L的2,4-D溶液1 ml效果最好,王广金25用2,4-D溶液处理杂交穗得到相同的结果。用该浓度重复处理柱头2-3次能有效提高得胚率2,32。小麦散粉前授玉米花粉后用250mg/L的2，4-D处理得胚率最高36。也有试验5,22认为150mg/kg是最适宜的2,4-D浓度。2,4-D处理授粉后的杂交穗或小花促进子房发育膨大，直至能进行离体培养。进一步研究发现小麦玉米远缘杂交时施用2,4-D+AgNO3的效果好于单独施用2,4-D，其机理可能是加入硝酸银可以阻止2,4-D诱导处理的副作用产物乙烯利，减缓脱落过程，容易形成单倍体胚。 3.2.2 2,4-D处理方法目前2,4-D浓度的处理方法主要有节间注射法、小花滴注法、喷施柱头法、整穗浸渍法。在成胚率方面，喷施柱头法(15.65%)节间注射法(11.31%)整穗浸渍法(10.02%)37。普遍认为2,4-D喷施柱头法具有胚率高、操作简易等优势。胡远林38认为授粉后1h首次进行2,4-D穗下节注射+子房滴注的单倍体植株获得率和获得效率分别达到37.50%和3.33%，诱导效果最好。但试验操作中发现，用2，4-D喷施柱头或小花滴注后套袋隔离后，纸袋内
