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1、分子生物学与基因工程原理实验报告 -绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆和表达姓名：张可欣 王跃学号：201220142012 201220142022组别:1组背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP基因由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由 238个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27.0 kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60处理。1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质
2、中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽 240 nm，由 11个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。实验一
3、 质粒DNA的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒 DNA提取方法：碱裂解法。该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的质粒 DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子，分子量范围从1kb到200kb。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒 DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。有些质粒
4、复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达 10-200个拷贝。当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒 DNA可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转
5、入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒 DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒 DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的分离；质粒DNA的纯化。1、细菌的生长和质粒的扩增 从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒（如 pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或 2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒 DNA。但对于严谨型质粒（如 pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继
6、续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。2、菌体的收集、裂解和质粒 DNA的分离 质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：（1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒 DNA大得多。（2）从细胞中提取得到的大肠杆菌 DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒 DNA是共价闭合的环状分子。这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入 SDS（十二烷基硫酸钠）和 NaOH使菌体裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体DNA变性，但闭环质粒 DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时（
7、如加入酸性的 NaAc或 Kac中和碱性 NaOH），质粒 DNA链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心，可以使染色体 DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。3、质粒 DNA的提纯 对于小量制备的质粒 DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白质及 RNA，达到纯化的目的。质粒 DNA分子具有三种构型：共价闭合环形 DNA（cccDNA，SC构型）、开环 DNA（OC构型）和线性分子（L构型）。在细菌体内，质粒 DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒 DNA，尽管分子量相同，但具有不同
8、的电泳迁移率。其中走在最前沿的是 SC DNA，其后依次是 L DNA和 OC DNA。三、实验材料、仪器及试剂1.在含有pEGFPN3质粒的DH5平板上菌落上挑取菌种，置于含有5mLLB培养基的试管中。摇晃过夜。 在含有 pET-28a质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。2、使用仪器 恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱。3. 试剂 LB培养基的配制：组成液体固体蛋白胨（Trypton）10g10g酵母提取物（Yeast Extract）5g5gNaCl10g10g琼脂（Agar）15g蒸馏水定容至1000ml定容至1000ml 培养基配制
9、完成后要进行两小时的灭菌处理。溶液：50ml葡萄糖，25mM Tris-HCl（PH8.0），10mM EDTA。溶液（现用现配）：0.2N NaOH，1% SDS（先加水，再加 NaOH和 SDS）。溶液（100ml）：60ml 5M KAc，60ml 11.5ml冰醋酸。4、 实验步骤1. 分别取N3，28质粒。取2.0ml DH5培养液倒入2.0mL圆底离心管中,13000rpm离心1min。2.在同一离心管中，重复1。离心后弃上清,再离心.3.弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。（沉淀为收集的菌体）4.菌体沉淀重悬浮于100L溶液中(需用涡旋仪剧烈振荡混匀),室温下放置10m
10、in。（破碎细胞）5.加入新配制的溶液200l（SDS与NaOH等量混匀）,盖紧管口，快速温和颠倒（手动）离心管5次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5min。（使拟核DNA和蛋白质变性）6.加入150L预冷的溶液，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中15min,13000rpm离心5min。（中和，质粒DNA恢复超螺旋）7.上清液350l移入干净离心管中，加入450l等体积的氯仿/异戊醇(24：1),振荡混匀，13000rpm离心2min。（沉淀蛋白质等）8.将水相移入干净离心管中，在通风橱中加入450l等体积的氯仿/异戊醇(24：1)振荡混匀，13000rpm离心2m
11、in。（沉淀蛋白质等）9.将水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后，置于室温下2min，然后13000rpm离心5min。(洗涤，沉淀质粒DNA）10.弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入 1mL 70乙醇洗沉淀一次，振荡混匀后，13000rpm离心5min。(洗涤，沉淀质粒DNA）11.吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。12.将沉淀溶于30L ddH2O中，18L用于实验二酶切，12L剩余样品作为参比用于实验三电泳。注意事项：氯仿/异戊醇是有机溶剂，容易腐蚀移液枪，因此在吸取氯仿时，要直上直下操作，及时退掉枪头，防止移液枪被腐蚀。实验二 质
12、粒DNA酶切及浓度的测定一、实验目的：学习使用限制型内切酶进行DNA酶切的原理和方法。学习利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。2、 基本原理：1.迄今已发现了3000多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。 II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoRI、HindIII、BamHI和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上
13、，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoRI识别GAATTC；HindIII识别AAGCTT;BamHI识别GGATCC;NotI识别GCGGCCGC）；而另一些识别不连续的序列（如BglI识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶酶切DNA后形成两种类型的末端： (i)两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如EcoRI酶切后产生 5-GAATTC-33-CTTAAG-5末端；(ii)两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心，产生平末端，如Hae酶切后产生5-GGCC-3 3-CCGG-5 末端。 DNA连接酶能够催化在两条D
14、NA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3-末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团（-P）。 53 35（1）pET-28质粒全图谱：表达EGFP蛋白使用的pET-28原核载体质粒包含有在多克隆位点两侧的His-tagpolyHis编码序列；用于表达蛋白的T7启动子，T7转录起始物以及T7终止子；选择性筛选使用的lacI编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322启动子，以及为产生单链DNA产物的f1启动子。（2）pEGFP-N3质粒全图谱：实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-N3的蛋白质编码序列。此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。2.核酸分子在 260nm下有最大吸光值，因此可以通过260nm下核酸的吸光值计算核酸浓度（mg/ml），并通过测定与 280nm和 230nm的比值，估算 DNA的纯度。三、实验材料与仪器1、实验材料 p
