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1、荧光定量PCR的原理及临床应用,苏晓霁,如何做一个“聪明”的实习生,实习的目的就是对在校所学的理论知识和实验技能，在临床的实际工作中进行实践、巩固和提高。 如何做到： 实习之前要复习理论知识和实验课内容 “理论先行” 实习过程中要“聪明” 做好实习笔记，用心思考，实习之外下功夫,如何做一个“聪明”的实习生,聪 明,耳：认真听老师的说明和讲解,看：仔细看老师的操作,问：有疑问要多提问，多讨论,心：要用心去思考,日月：要每天每月坚持做到,内容概要,PCR的定义和原理 荧光定量PCR的原理和分类 荧光定量PCR结果的分析 荧光定量PCR在临床的应用,PCR的定义,PCR是Polymerase Cha
2、in Reaction的缩写，中文称为聚合酶链式反应，由变性、退火及延伸几步反应组成一个周期,循环进行,可使目的DNA得以迅速扩增。 由美国PE公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCR技术的跨时代意义，Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。,PCR的原理,变性：双链DNA在高温下解开成单链的过程 。温度一般为95左右。,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,加热,PCR的原理,退火：温度下降后，两条
3、配对的单链DNA重新结合为双链的过程。温度一般为5060。,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC,GGACTCGACACT,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC,GGACTCGACACT,降温,PCR的原理,延伸：DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应 。温度一般为72左右。,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,
4、CCACTGCCTCTC,GGACTCGACACT,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA,GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT,恒温,普通PCR的原理,普通PCR的原理,PCR反应成分： 1.模板DNA 2.引物 3.四种脱氧核糖核苷酸 4.DNA聚合酶(Taq酶) 5.反应缓冲液、Mg2+等 6.荧光探针（荧光定量PCR）,Taq酶的发现,在Taq酶发现之前，实验室的PCR反应中运用的是大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段。 Klenow酶不耐高温，9
5、0加热后会变性失活，每次循环结束都要加入新鲜的酶。 而且DNA的延伸是在37完成，模板和引物容易错配，造成反应的特异性很差。,Taq酶的发现,美国的嗜热菌研究室在黄石国家公园温泉中发现了嗜热菌(Thermus aquaticus)株，Cetus公司研究人员从中分离了Taq DNA聚合酶 特点：耐高温：70 2h 活性90%，93 2h 活性60%，95 2h 活性40% ； 延伸温度较高(一般为72 )：大大提高了扩增特异性、灵敏性和扩增效率。,荧光定量PCR,概念：在PCR反应中加入荧光基团，利用荧光信号累积或变化实时监测整个反应过程，最后通过特定数学模型对未知模板进行定量分析的方法。 实时
6、荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems，ABI公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。,实时荧光定量PCR的原理,利用荧光信号的变化实时监测PCR反应的每个循环的扩增产物量的变化。 通过Ct值和标准曲线分析对起始标本的模板量进行定量分析。,与普通PCR的比较,普通PCR完成后，一般只对扩增的最终产物量进行分析，分析结果多为定性或者半定量结果。 荧光定量PCR通过监测荧光值的变化，体现每一个循环的扩增产物量的变化，分析结果为定量结果。,与普通PCR的比较,普通PCR完成后，才能进行扩增产物的分析，而且分析的过程可能产生一定的生物危害和环境污染。 荧光定量PCR
7、的扩增和产物分析过程是同时完成的，而且在封闭的反应体系中进行，比较安全，易于处理。,常用的名词概念,本底信号（Baseline） 荧光阈值（Threshold） Ct值（Ct value） 扩增曲线,前15个循环荧光信号的均值，可手动调节选择,默认是第315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，也可手动调节,扩增过程中，产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数,常用的名词概念,Threshold,Baseline,Ct value,荧光强度 Rn,扩增循环数,对数增长期,实际中的运用,左图为5个数量级的标准品扩增后得到的荧光曲线， 右图以Ct值为纵坐标，lgXs为横坐标，可计算得出标准曲
8、线,实时荧光定量PCR的分类,目前的实时荧光定量PCR均是基于荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的原理。,荧光共振能量转移（FRET）发生的条件,荧光基团和淬灭基团都能发射荧光 荧光基团的发射光谱和淬灭基团的激发光谱需有效重叠 荧光基团和淬灭基团应足够的近（10nm）,波长,信 号 强 度,常见的实时荧光定量PCR,TaqMan探针法实时荧光定量PCR 分子信标探针法实时荧光定量PCR 双链DNA交联荧光染料法实时荧光定量PCR 双杂交探针法实时荧光定量PCR 蝎形探针法实时荧光定量PCR,探针的荧光标记,探针在其5端标记
9、一个荧光基团，如6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)等 探针在其3端标记一个淬灭基团，如6-羧基-四甲基罗丹明(TAMRA),TaqMan探针法实时荧光定量PCR,引物延伸所用到的DNA聚合酶Taq酶同时具有53方向核酸聚合酶活性，还具有对聚合延伸中遇到与靶序列结合的核苷酸序列的53核酸外切酶活性。,分子信标探针法实时荧光定量PCR,茎环结构的分子信标探针,荧光染料法实时荧光定量PCR,最常用的染料就是SYBR Green，游离时只发出微弱荧光，当它非特异性与双链DNA小沟结合后，荧光强度可增大1000倍。所以，反应中发出的荧光信号与扩增产生
10、的DNA双链的量成正比。,几种方法的比较,荧光定量PCR在临床的应用,在实际的临床应用中，TaqMan法的荧光定量PCR比较多见。 TaqMan法特异性高，重复性好，价格适中，可以满足临床上检测特定项目的要求。,荧光定量PCR在临床的应用,常见的异常结果： 假阳性、假阴性和“灰区” 如何发现异常结果： 设定阳性对照、阳性质控（低值、中值、高值）和阴性对照 加入内标试剂与标本一起扩增，帮助判断假阴性结果出现,荧光定量PCR在临床的应用,如何判断： 标本结果为阴性，而内标荧光不随着扩增而增加，则可判断为假阴性结果,荧光定量PCR在临床的应用,出现异常结果的原因： 试剂和实验器材的原因：试剂过期失效
11、，耗材中存在DNase、RNase、抑制物等 实验操作不当 标本间污染：相临的测试孔结果相近 气溶胶污染：大范围的阳性结果 仪器故障,荧光定量PCR在临床的应用,有效防止和消除气溶胶污染的方法： 保持实验室的通风，最好有机械通风设备 10%次氯酸钠溶液的喷洒和擦拭 1M HCl溶液的浸泡 紫外线的照射：500bp片段敏感 75%或无水乙醇溶液喷雾,荧光定量PCR在临床的应用,在反应体系中使用dUTP和UNG酶消除以往实验的污染影响 UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）：选择性水解断裂含有dU的双链和单链中的尿嘧啶糖苷键，在碱性介质和高温下会进一步水解断裂，酶的最佳活性温度是50，在95 失活。,荧
12、光定量PCR在临床的应用,气溶胶污染物,加入UNG酶,荧光定量PCR在临床的应用,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,扩增,加入dUTP,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA
13、3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,潜在气溶胶污染物,50 2min,加入UNG酶,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,荧光定量PCR在临床的应用,乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA) EB病毒DNA(EBV-DNA) 人巨细胞病毒DNA(HCMV-DNA) 肺炎支原体DNA(MP-DNA) 肺炎衣原体DNA(CP-DNA),临床标本
14、的采集,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性/AIDS患者人巨细胞病毒感染的辅助诊断和疗效监控。 临床上可以采用的标本类型：尿液、乳汁、血清、血浆或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,巨细胞病毒DNA的提取（血清或血浆）,100l血清 或血浆,100l DNA浓缩液,去除上清液，保留沉淀,12000rpm，10min,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,巨细胞病毒DNA的提取（血清或血浆）,加入50l DNA提取液,剧烈振荡混匀5-10s,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,巨细胞病毒DNA的提取（血清或血浆）,振荡混匀510s,12000rpm，
15、5min,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,巨细胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）,1ml尿液或乳汁,去除上清液，保留沉淀,12000rpm，5min,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,巨细胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）,加入50l DNA提取液,剧烈振荡混匀5-10s,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,巨细胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）,振荡混匀510s,12000rpm，5min,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）,1ml抗凝全血,1ml生理盐水,0.3ml淋巴细胞分离液,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）,水平离心机2500rpm，15min,淋巴细胞层,吸取淋巴细胞悬液,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）,淋巴细胞悬液,去除上清液，保留沉淀,12000rpm，5min,人巨细胞病毒DNA定量检测试剂盒,人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）,加入50l DNA提取液,剧烈振荡混匀5-10s,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,人巨细胞病毒DN
