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1、RNA-Seq质控(RSeQC)RNA-seq提供了有关基因组中所有转录元件的有价值的信息,已经被广泛地用于转录组研究。使用RNA-seq,研究者能够描述基因表达谱,研究选择性剪接、鉴定新的转录本,检测异常转录本及编码变异等。质量控制(Quality Control,QC)对于保证RNA-seq高质量且适合随后分析是至关重要的。我们使用RSeQC程序包全面地评估RNA-seq结果质量,例如序列质量、GC偏倚、PCR偏倚、核苷酸组成偏倚、序列深度、链特异性、覆盖均一性,和基因组结构上的片段分布等,以确保后续分析的可靠性。基于原始测序数据的质控(例如FastQC)不足以保证RNA-seq数据的可用
2、性。测序深度必须饱和,以便执行许多RNA-seq应用,例如表达谱,选择性剪接分析,新亚型(isoform)鉴定,转录组重建等。非饱和测序深度给出不准确的评估(例如RPKM和剪接索引),不能检测低丰度剪接联结点(splice junctions),因此限制了 许多分析的准确性。有许多工具,例如FastQC(http:/www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)、htSeqTools,FASTX-ToolKit(http:/hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit)和SAMStat,但是都集中于原始序列相关的度量。
3、RNA-SeQC缺乏许多重要的功能,例如饱和性检查。RSeQC被开发以解决这些需求。基本模块快速检查:序列质量、核苷酸组成偏倚、PCR偏倚和GC偏倚。RNA-seq特异模块:1)bat_stat.py比对片段检查(QC失败、unique mapped、splice mapped、mapped到合适对的reads等)2)inner_distance.py 配对reads间的内部距离分布,应该与割胶大小匹配。3)geneBody.coverage.py将所有转录本缩放到100 nt,并计算每个核苷酸覆盖的reads数,最后计算出一个沿gene body的覆盖谱。4)read_distributio
4、n.py计算比对到编码exons、5UTR exons、3UTR exons、introns和intergenic区的read比例。例如对于polyA+ RNA-seq的实验方案,reads倾向于在3UTR过代表。5)RPKM_saturation.py通过对总的比对reads重采样(jackknifing),评估在当前测序深度下的RPKMs。使用相对错误率来测量评估的RPKM的准确性(100x|RPKMobs-RPKMreal|/RPKMreal)6) junction_saturation.py判断当前测序深度是否足够用来执行选择性剪接分析。7)infer_experiment.py通过对BAM文件进行采样,判断测序是否是链特异的,若是的话,是怎么分布的。8)junction_annotation.py将所有检测到的splice junction分为known, complete novel和partial novel(与ref genome相比)。9)RPKM_count.py计算原始reads计数和RPKM值(每个exon、intron及mRNA区)10)bam2wig.py将BAM文件转成wiggle文件以可视化。Wiggle能容易地转成bigwig(用UCSC的wigToBigWig工具)下载:http:/