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1、qPCR 技术在宿主细胞 DNA残留检测及细胞培养监控中的最近 进展 任育华 Jan.9th, 北京2| Life Technologies | June 209Life Technologies Profile美国生命技术公司 美国生命技术公司 美国生命技术公司 美国生命技术公司营业收入 $3.2B产品种类 50,00国家 160员工数量 9,60客户数量 75,00专利许可 3,60Note: LTM revenue as of September 30, 209; does not include Mas Spec JV revenue3| Life Technologies | Jun
2、e 209临 床分子 诊 断基因治 疗药 物再生 药 物应 用生物 产业法医食品 检测动 物健康 科研PCR技 术测 序技 术细 胞 (分 选 ,处 理 ,分析 )“ Tools Provider” 提供工具 “ Solutions Provider” 提供解决方案Expanding Adresable Market拓展潜在市场4| Life Technologies | June 209在生物工艺的上下游及分析中提供的解决方案 在生物工艺的上下游及分析中提供的解决方案 在生物工艺的上下游及分析中提供的解决方案 在生物工艺的上下游及分析中提供的解决方案POROS色谱分析Cel Line Dev
3、elopment Cel Culture Purification FormulationGIBCO细胞培养培养基PD-Direct 服务残留 DNA定量分析 细菌 /真菌鉴定支原体检测 病毒的检测 SEQ 鉴定和监测系统5| Life Technologies | June 209生物制品在分析质控中面临的挑战 生物制品在分析质控中面临的挑战 生物制品在分析质控中面临的挑战 生物制品在分析质控中面临的挑战产 品 复杂 生 产过 程 复杂完善的工 艺 分析和 产 品分析需要 贯 穿在整个 产 品 开发 的过 程杂质 的状况 备 受挑 战 , 杂质 分析极 为关键污 染物的状况必 须 被清晰了解
4、并有效去除开发 工 艺 依 赖 于大量且繁 复 的数据 (工 艺 , 分析及 临 床数据）对 工 艺 、分析及 产 品的 验证 要求越来越 严 格杂质分析 对不希望出现的，具有 潜在毒性的，自然状态 下存在于宿主细胞系中的元素的检测。 如：残留 DNA、残留蛋白的检测污染物分析 对不希望出现的，具有 潜在毒性的，非自然状 态下存在得，在生产过程中由外部引入的元素 的检测。 如：支原体，内毒素等工艺分析 在工艺开发的过程中， 用于监控关键衡量指标 的检测如： pH, 电导率产品分析 对产品特性的检测，无论检测的阶段6| Life Technologies | June 209Biologics
5、In the NewsVirus Shuts Genzyme Plant, Holds Up Drugs for 8,00By Erin Ailworth and Robert Weisman June 17, 209 Vesivirus 217Genzyme is ading steps to increase the robustness of its raw materials screni g and viral removal processes. Top 6 Drugs Tiped to be Biotech Products by 2014June 17, 209 12:27pm
6、 EDTBiotech drugs to dominate 2014 blockbuster league table Led by Avastin, Humira, Rituxan, Enbrel, Lantus, HerceptinBiotech to account for 50% of top 10 drugs7| Life Technologies | June 209DNA残留定量检测 残留定量检测 残留定量检测 残留定量检测为什么很重要？源自细胞培养产生的生物制品 含有特定的杂质，包括宿主细 胞蛋白及 DNA残留终产品中宿主细胞 DNA残留量必须遵循 WHO, EU,FDA和EM
7、EA 监管条例目前的检测方法不够快速、准 确、灵敏8| Life Technologies | June 209DNA残留定量检测 残留定量检测 残留定量检测 残留定量检测监管要求 监管要求 监管要求 监管要求终产品中 DNA含量必须低于 10ng/治疗剂量 (WHO)终产品中的 DNA 含量必须尽可能低，此含量是由高度灵敏的方法 确定的 (FDA)建议使用灵敏度达到 10 pg 的检测方法检测 DNA水平 (FDA)适当开展的 DNA去除方法许可研究可作为逐批产品放行的替代方法 (FDA)9| Life Technologies | June 209Residue DNA 现在常见的检测方法
8、分子 杂 交法 目前国内使用最 为 普遍的方法 可以分同位素 32P标记 、地高辛 标记 和生物素 标记存在的 问题 ： 耗 时 耗力，干 扰 因素多，重 复 性差 不能 进 行定量分析 对 某些 单 抗 药 品，为 达到符合要求的 检测 限，需要大 剂 量的 样 本，成本高 出 现 假阳性或假 阴 性 需要由生 产单 位提供宿主菌（ 细 胞）DNA10| Life Technologies | June 209几 种 方法 检测 灵敏度的比 较引自 ” performance Characteristics of Host-Cel DNA Quantification Methods”, S
9、hivani Mehta etc. Bioproces 1 | Life Technologies | June 209209版美国药典 对实时 定量 PCR法 检测 DNA残留检测的 推荐：实时定量 PCR技术已经有成熟的应用，可以实现定量检测。较分子杂交法只能实现半定量，实时定量 PCR因为能实现定量更为建议采用。定量方法能得到更准确、精确 的结果，有利于过程的监督和控制。12| Life Technologies | June 209resDNASEQ CHO DNA残留定量试剂盒 PrepSEQ残留 DNA样品制备试剂盒 +模块 R750型快速实时荧光定量 PCR仪AcuSEQ 软件
10、V1.0resDNASEQ CHO DNA残留定量系统 残留定量系统 残留定量系统 残留定量系统第一个完整的基于实时 qPCR系统的 CHO DNA残留定量系统，配备可选的自动化样品制备系统13| Life Technologies | June 209qPCR技术，高灵敏度地实现 CHO DNA残留的定量检测优化的样品制备提取，从复杂基质中定量回收 DNA操作方便，五小时内获得结果高特异性检测 CHO DNA，对其他无关DNA无交叉反应完整的检测系统，包括样品提取试剂盒， TaqMan分析及预混液， DNA标准品，仪器和软件提供自动化样品制备的操作方案resDNASEQ CHO DNA残留定
11、量系 统14| Life Technologies | June 209宽泛的动力学范围，灵敏度高 宽泛的动力学范围，灵敏度高 宽泛的动力学范围，灵敏度高 宽泛的动力学范围，灵敏度高1 2 3 45 630 fg6 30 fg53 pg4 30 pg330 pg2 3 ng1DNA per rxn CHO DNA标准品经 10倍连续稀释后，产生的扩增曲线15| Life Technologies | June 209线性和 线性和 线性和 线性和 PCR效率分析 效率分析 效率分析 效率分析y = -1.451Ln(x) + 25.601R2 = 0.995101520253035400.01
12、 0.01 0.1 1 10 10 100CHO DNA pg/reactionCT PCR eficiency98.82%CHO DNA标准品经 10倍连续稀释后，产生的标准曲线16| Life Technologies | June 209Specificity 特异性TaqMan 分析只检测 CHO DNA,且不受存在的其他外来 DNA的影响有 /无人 DNA存在时， CHO DNA标准品经 10倍连续稀释后，产生的标准曲线17| Life Technologies | June 2090.511.510kb1. 1kb lader2. 0 min (20 kb)3. 1 min (10
13、 -1.5 kb)4. 5 min (8 -1 kb)5. 10 min (7 0.6 kb)6. 30 min (6 0.5 kb)DNA Sonication10 min sonication30 min sonication0 min sonication1 min sonication5 min sonication一致的定量 结 果高分子量 DNA和片段化 DNA不同分子量的 CHO DNA标准品经 10倍连续稀释后，产生的标准曲线 不同大小的 DNA片段，均能获得一致的定量结果18| Life Technologies | June 209DNA纯化方案示意图样品PCR兼容的核酸溶
14、液裂解 磁珠 +结合溶液 纯化步骤磁珠分离 磁珠分离 洗脱PrepSEQ DNA残留的样品制备一个操作流程同时适用于 :高蛋白浓度低 pH高盐19| Life Technologies | June 209分析性能评估 分析性能评估 分析性能评估 分析性能评估 实验设计 实验设计 实验设计 实验设计采用生物制药纯化中典型的替代样品进行测试采用三个平行待测样品，分别加入已知量的 CHO DNA标准品采用 PrepSEQ DNA残留样品制备试剂盒制备样品采用 resDNASEQ CHO DNA残留定量试剂盒分析样品使用分析软件计算结果计算出 DNA回收率低变异系数证明结果具有良好的一致性20| L
15、ife Technologies | June 209分析性能评估 分析性能评估 分析性能评估 分析性能评估 典型的抗体 纯 化 过 程中的 样 品4.63%0.869.92%9.134.89%105.26Average 2.48%0.814.25%9.652.28%109.48Asay 38.3%0.8724.1%7.979.9%86.5Asay 2 3.1%0.891.4%9.762.5%19.8Asay 1%CV for Triplicatespg DNA recovered%CV for Triplicatespg DNA recovered%CV for Triplicatespg DNArecoveredBufer1 pg DNA spike10 pg DNA spike10 pg DNA spikeTest Sample待测的样品基质： 10 mg/mL IgG, NaCl, NaPO4 (pH 7.5)三个样品分别加有 10 pg、 10 pg或 1 pg的 CHO DNA标准品21| Life Technologies | June 2097.92%0.765.83%9.543.28%15.3Average 2.47%0.847.1%9.623.8%12.5
