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1、第四章 药物定量分析与分析方法验证,第一节 定量分析样品的前处理方法 第二节 定量分析方法的特点 第三节 药品分析方法的验证 第四节 生物样品分析方法的基本要求,第一节 定量分析样品的前处理方法,在进行药物定量分析之前，一般需根据分析方法的特点，化学原料药的结构与性质及药物制剂的处方组成采用不同的方法对试样进行前处理，以满足所选用的分析方法对试样的要求。 含金属或卤素、氮、硫、磷等元素的药物的分析方法通常可分为： （1）不经有机破坏的分析方法 （2）经有机破坏的分析方法,一、不经有机破坏的分析方法 不对药物分子中的有机结构进行完全破坏; 仅选用适当的溶剂溶解样品使待测元素离子电离或经简单回流处
2、理使有机结合的待测元素原子离解而转化为无机盐类后测定。 适用于含金属有机药物或结合不牢固的含卤素等药物的分析。 根据操作方法不同，主要有：直接测定法、经水解后测定法、经还原分解后测定法。,直接测定法 凡金属原子不直接与碳原子相连的含金属的有机药物或某些C-M（金属原子直接与碳原子相连）键结合不牢固的有机金属药物，在水溶液中可电离，不需经有机破坏，直接进行测定。 配位滴定法：利用二价金属离子可与乙二胺四乙酸二钠形成配位化合物，直接乙二胺四乙酸二钠滴定液滴定。 氧化还原滴定法：利用不同价态的金属离子的氧化还原性，选用适当的滴定液直接或间接滴定法测定含量。,例1：葡萄糖酸钙的含量测定 取本品，加水溶
3、解后，在氢氧化钠碱性条件下，以钙紫红素为指示剂，用乙二胺四乙酸二钠滴定液滴定至溶液自紫色转变为纯蓝色。,例2：葡萄糖酸锑钠的含量测定 本品所含的五价锑具有氧化性，在酸性溶液中可氧化碘化钾并析出碘，选用间接碘量法，用硫代硫酸钠滴定液滴定。,经水解后测定法 碱水解后测定法：将含卤素的有机药物溶解于适当的溶剂中，加NaOH溶液回流使其水解，将有机结合的卤素转变为无机形式的卤素离子，然后选用间接银量法。本法适用于含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物，如卤素和脂肪碳相连者。 酸水解后测定法：将含金属的有机药物与适当的矿酸（如盐酸）共热，将不溶性金属盐类水解置换为可溶性盐，然后选用配位滴定或剩余酸
4、碱滴定法测定。,例2：三氯叔丁醇的含量测定 取本品，溶于乙醇后，加NaOH溶液并加热回流，使有机结合的氯水解生成NaCl，与AgNO3生成AgCl沉淀，过量的AgNO3用NH4SCN溶液滴定(指示剂:Fe3+)。,例1：十一烯酸锌的含量测定 本品与稀盐酸共沸，水解生成十一烯酸和氯化锌，用乙二胺四乙酸钠滴定液直接滴定锌离子。,经还原分解后测定法。 含碘有机药物，当碘原子直接与芳环连接时，碘的结合比较牢固，采用碱性溶液回流是难以使C-I键断裂，但可在碱性人溶液中加入还原剂（如锌粉）回流，使其转化为无机碘化物后测定。,例：泛影酸的含量测定 取本品约0.4g（精密称定），加NaOH试液30ml与锌粉1
5、.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤三次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用AgNO3（0.1mol/L）滴定液滴定。,+ 11NaOH + 3Zn ,NaI + AgNo3 AgI+ NaNO3,碘他拉酸、胆影酸、碘番酸等均采用同法测定,胆影酸,碘他拉酸,碘番酸,二、经有机破坏的分析方法 含金属及含卤素、氮、硫、磷等有机药物结构中的待测原子与碳原子结合牢固者，用水解或氧化还原的方法难以将有机结合的待测原子转变为无机形式； 须采用有机破坏的方法将药物分子中有机结构部分完全破坏，使有机结合形式的待测原子转变为可测的无机离子
6、（或氧化物、无氧酸等）后方可分析。有机破坏方法包括：湿法破坏、干法破坏。,湿法破坏 适用于含氮有机合成药物分析的前处理，在生物制品分析中用于氮（包括蛋白质）、磷、硫柳汞及氯化钠测定法的前处理； 亦可用于生物样品中金属元素测定时生物基质的去除。 主要分解剂：硫酸 辅助分解剂：硝酸、高氯酸、过氧化氢。 湿法破坏可分为：硫酸-硝酸法、硫酸-高氯酸法、硫酸-硫酸盐法、硝酸-高锰酸钾法。,以硫酸-硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法凯氏定氮法原理 将含氮有机药物与硫酸和硫酸盐在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被氧化分解成二氧化碳和水，有机结合的氮则转变为无机氨，并于过量的硫酸结合为硫酸氢铵及硫酸铵
7、； 经NaOH碱化后释放出氨气，并随水蒸汽馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。 加入硫酸盐的作用是：提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。,以硫酸-硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法凯氏定氮法原理（续） 催化剂（如汞或汞盐、硒粉、铜盐、二氧化锰）：加快氧化分解的速度，以缩短反应时间。 硫酸铜因价廉易得，且无挥发、毒性低，常被用作本法的催化剂。 对某些难以分解的药物（如含氮杂环结构药物），在氧化分解过程中常需加入辅助氧化剂，使分解完全并缩短分解时间。常用的辅助氧化剂有30%过氧化氢和高氯酸。高氯酸为强氧化剂，用量不宜过大。,以硫酸-硫酸盐法
8、为基础的含氮有机药物定量分析方法凯氏定氮法操作（常量法）,氧化分解,吸收与滴定,以硫酸-硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法凯氏定氮法应用范围 中国药典主要应用本法测定含氨基或酰胺结构的药物含量； 对于以偶氮或肼等结构存在的含氮药物，因在消解过程中易于生成氮气而损失，需在消解前加入锌粉还原后再依法处理； 杂环中的氮，因不易断键而难以消解，可用氢碘酸或红磷还原为氢化杂环后再行消解； 对于含氮量较高（10%）的样品，可在消解液中加入少量多碳化合物，如蔗糖、淀粉等作为还原剂，以利于氮转变为氨。,干法破坏 本法主要适用于含卤素、硫、磷等有机药物分析的前处理，亦可用于某些药物中硒及砷盐的检查。根据破
9、坏方式可分为高温炽灼法和氧瓶燃烧法。 高温炽灼法： 原理： 将含待测元素的有机药物经高温灼烧灰化，使有机结构分解而到测元素转化为无机元素或可溶性无机盐，以供分析。,应用范围：本法主要适用于含卤素药物的鉴别，亦可用于含磷药物的定量测定和药物中砷盐的检查。根据分析对象与目的不同，常加无水Na2CO3、Mg（NO3)2、Ca(OH)2、ZnO等辅助灰化。 含碘药物的鉴别：将适量样品置于坩锅中。直火炽灼，或与无水Na2CO3混匀后，炽灼至紫色的碘蒸汽产生。 含氟、氯、溴等元素药物的鉴别：将适量样品置于坩锅中，与无水Na2CO3（或Na2CO3-K2CO3混合物）混合，炽灼至完全灰化，加水溶解后鉴别。,
10、含磷药物（如甘油磷酸钠注射液）的定量测定：精密称取样品1ml，置于瓷坩锅中，加氧化锌1g，加热碳化后在600炽灼1h，放冷，加水与盐酸个5ml，加热煮沸使溶解后，用钼蓝比色法测定。 砷盐的检查：有机结合的砷经与无水Na2CO3或Ca(OH)2、Mg(NO3)2共热（700）转化为无机砷酸盐后，依法检查。本法主要用于高分子化合物（如：右旋糖酐铁）或植物提取物（如：大豆油）中砷盐的检查，亦应用与少数有机药物（如吡罗昔康、布美他尼等）.,氧瓶燃烧法： 原理：将含待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭燃烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分解为CO2和H2O，而待测元素根据电负性的不同转化为不同的氧化物（
11、或无氧酸），被吸收于适当的吸收液中（多以酸根离子形式存在）以供分析。本法适用于含卤素或硫、磷等元素的有机药物的鉴别、限度检查或含量测定，亦可用于药物中杂质硒的检查。,仪器装置：燃烧瓶为500ml、1000ml或2000ml的磨口、硬质锥形瓶，瓶塞应严密，底部熔封铂丝一根（直径：1mm），铂丝下端做成网状或螺旋状，长度约为瓶身长度的2/3。通常取样量为1020mg，使用500ml燃烧瓶；加大样品取样量（200mg）时可选用1000ml或2000ml的燃烧瓶,AF氧瓶燃烧装置与样品包装操作图,操作法：,燃烧瓶内加入规定的吸收液瓶口用水湿润,小心急速通入氧气后盖上表面皿,点燃包有供试品的滤纸，迅速放
12、入燃烧瓶中,按紧瓶塞，用少量水封闭瓶口,俟燃烧完毕后充分振摇，使生成的烟雾完全吸收,用少量水冲洗瓶塞和铂丝，合并洗液和吸收液,用同法另作空白实验,依法进行鉴别、检查或含量测定,例：碘苯酯的含量测定 本品主要为10-对碘苯基十一酸乙酯与邻、间位的碘苯基十一酸乙酯的混合物。,碘苯酯,测定方法,O2/燃烧,I2(HIO3、HIO、HI),3NaIO,NaIO3 + 2NaI,3Br2 + I- + 3H2O,IO3- + 6HBr,Br2 （过量的）+ HCOOH,2HBr + CO2,IO3- + 5I- + 6H+,3I2+ 3H2O,OH-,I2 + 2Na2S2O3,2NaI + Na2S4
13、O6,氧瓶燃烧法中的装置和材料有（） A. 磨口硬质玻璃锥形瓶 B. 磨口软质玻璃锥形瓶 C. 铂丝 D. 铁丝 E. 无灰滤纸 F. 铝丝,自测题,氧瓶燃烧法可用于 A. 含卤素有机药物的含量测定 B. 醚类药物的含量测定 C. 检查甾体激素类药物中的氟 D. 检查甾体激素类药物中的硒 E. 芳酸类药物的含量测定,氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为（） A. H2O2溶液 B. H2O2-NaOH溶液 C. NaOH溶液 D硫酸肼饱和液 E. NaOH-硫酸肼饱和液,容量分析法的特点 在容量分析法中，常需借助指示剂的颜色改变来判断滴定终点的到达。但滴定终点与反应的化学计量点不一定
14、恰好符合，二者之差称为滴定误差，是容量分析误差的来源之一，为了减少滴定误差，需要选择合适的指示剂。 容量分析法所用仪器价廉易得，操作简便、快捷，方法耐用性高，测定结果准确（通常相对误差0.2%）。但专属性（选择性）较差，一般适用于含量较高的试样分析（如化学原料药）,容量分析法的有关计算 滴定度：每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物的质量，中国药典规定滴定度用mg表示。 滴定度的计算： 设被测药物分子（A）与滴定剂（B）之间的反应如下：,反应完全时，被测药物的量（WA）与滴定剂的量（WB）的关系为：,MA：被测药物分子量 MB：滴定剂分子量,被测药物的量（WA）可有下式计算：,nB：被测药物
15、消耗的滴定剂的摩尔数 mB：滴定液的摩尔浓度 VB：被测药物消耗的滴定剂的体积,单位体积（VB=1mol）的滴定液相当于被测药物的量被称为滴定度，用T表示，量纲为mg/ml。,例：维生素的含量测定 用碘量法测定维生素CM(C6H8O6)=176.13的含量时，碘滴定液的摩尔浓度为0.05mol/L（以I2为单元），化学反应式如下： 求碘滴定液的滴定度T。,含量的计算： 用容量分析法测定药物的含量时，滴定方式有直接滴定法和间接滴定法。 直接滴定法：用滴定液直接滴定被测药物，被测药物的百分含量计算式如下：,若配置的滴定液的摩尔浓度与中国药典中规定的浓度不一致时，应将滴定度乘以校正因素F。,间接滴定
16、法：包括生成物滴定法和剩余量滴定法 生成物滴定法：被测药物与化合物A作用，定量生成化合物B，再用滴定液滴定化合物B。该法的百分含量计算方法与直接滴定法相同。 例：葡萄糖酸锑钠的含量测定,Na2S2O3滴定液的滴定度T,剩余量滴定法：先加入定量的过量的滴定液A，使其与被测药物反应，再用另一滴定液B来回滴定反应剩余的滴定液A。本法常需进行空白实验校正。 其百分含量可按下式计算：,W：供试品的称取量 TA：滴定液A的滴定度 FB：滴定液B的浓度校正因子 VB0：空白实验时消耗的滴定液B的体积 VBS：样品测定时消耗的滴定液B的体积,溴滴定液的滴定度T,二、光谱分析法 光谱分析法，是利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析。通过测定被测物质在光谱的特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对物质进行定性或定量分析的方法称为分光光度法。 中国药典收载的光谱分析法有：紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、荧光分析法等。,紫外-可见分光光度法 紫外光区：200400；可见光区：400760nm 朗伯-比尔定律 A：吸光度
