《残留溶剂GC检查方法的设计验证》由会员分享，可在线阅读，更多相关《残留溶剂GC检查方法的设计验证（37页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、残留溶剂GC检查方法的设计与验证,毛细管检查方法高青 北京市药品检验所,一、检测器 二、溶媒 三、供试品溶液的配制 四、顶空瓶中样品体积 五、色谱柱 六、温度 七、进样方式 八、提高灵敏度 九、提高分离度 十、未知峰归属 十一、方法验证,一、检测器,FID（火焰电离）、 NPD（热表面电离）和ECD（化学电离） ，应用范围分别为有机物、氮/磷化合物、电负性物质（卤代烃）。 多数情况下，三氯甲烷、DMF、DMSO均用FID检测，但需采取一些措施提高检测灵敏度。 四氯化碳则必须用ECD检测器。,以下三点注意：,FID质量型检测器，对有机物均有响应，只是对难电离的卤代烃和氮/磷化合物灵敏度比ECD、
2、NPD检测器低很多。 ECD半选择性的检测器，对多种类型化合物均有响应。如果含有其他非卤代烃溶剂，应进行系统适用性试验考察分离度。 如果采用FID检测器，同时又采用填充柱测定三氯甲烷，灵敏度达不到限度要求。,二、溶媒,选择原则：溶解样品，并对色谱柱无损坏 例如直接进样不能含GC不能分析的无机盐,顶空进样：,首选水，其次DMF、DMSO、不挥发酸碱溶液，不可使用盐酸溶液和氨水，可选择在8090C加热能溶解样品的试剂。温度太高爆瓶 如待查成分为苯、甲苯、三氯甲烷等水溶性不好的溶剂，可采用混合液，即先用少量乙醇或甲醇溶解待查溶剂再用水稀释。 当待测溶剂在有机相中的分配系数明显大于水相（例如三氯甲烷）
3、，对顶空进样来说采用有机相如DMF为溶剂不是很好的选择（K大，灵敏度低）；如果样品也只能在有机相中溶解，建议采用混合液。,直接进样：,水、合适的有机溶媒或混合液。对于非极性色谱柱，水对柱有影响，会缩短柱的使用寿命。,助溶方式：,有报道加5%SDS助溶。 顶空小平加盖后可超声加热助溶,三、供试品溶液的配制,不可超声或加热助溶 ，以免残留溶剂挥发；如果顶空进样，样品置顶空瓶封盖之后可以超声或加热溶解。大颗粒样品不可以研磨取样，只能取原态样品（或冷冻粉碎）。,顶空进样方式要求对照品配制与供试品配制方法应绝对一致，否则顶空瓶中气液平衡状态有差异（基质效应）。对照品配制最好采用标准加入法。,四、顶空瓶中
4、样品体积,顶空样品瓶中的样品体积（Vs）对分析结果影响很大，因为它直接决定了相比。CgCo/（K）其中Vg/Vs，KCs/Cg，当K时，样品体积改变对灵敏度影响很小。当K时，影响很大。例如，分析水中的二氧六环和环己烷（三氯甲烷），60C平衡，两者的K分别为642、0.04。当样品体积由1ml增加至5ml，二氧六环的峰面积只提高了1.3，而环己烷却提高了452。根据实际经验来说，20ml顶空瓶样品装量为5ml比较适当。,五、色谱柱,残留溶剂检查大多需要较高的分离度和检测灵敏度，通常采用毛细管色谱柱。填充柱口径大，造成溶剂峰扩散，检测灵敏度低。 实践证明，使用非极性至中等极性色谱柱，配合适当柱温梯
5、度可分离大部分有机溶剂。通常当待查溶剂数目仅两、三种时，可用极性较强的色谱柱，出峰快，分析时间短；当溶剂数目较多时，还是优选非极性至中等极性柱分离较好。,六、温度,色谱柱：初温应接近样品中最轻组分的沸点，而终温则取决于最重组分的沸点，升温速率则要依样品的复杂程度。 进样口：一般接近沸点最高的组分，但要低于易分解组分的分解温度。常用的条件是250C。 检测器：原则是避免流出色谱柱的组分冷凝。FID检测器通常设置为300C。,顶空瓶平衡温度：温度越高，蒸汽压越高，顶空气体的浓度越高，分析灵敏度越高。待测组分的沸点越低，对温度越敏感。但温度的改变只影响分配系数K，并不影响相比。例如水溶液中的甲醇、甲
6、乙酮、甲苯、正己烷和四氯乙烯，80C平衡温度与40C平衡温度相比，甲醇在顶空气体中的浓度增加5.15倍，甲乙酮浓度增加2.61倍，甲苯只增加25%，而正己烷和四氯乙烯，分别增加2.6%和10.4%。实际工作中往往是在满足灵敏度的条件下，选择较低的平衡温度。过高的温度可能导致某些组分的分解和氧化。一般采用高沸点溶剂时，样品比较稳定的情况下，推荐80C左右的平衡温度。,七、进样方式,作为残留溶剂检查，顶空进样有许多优越性，不需要对样品进行特殊处理，不用担心样品中不挥发组分对GC分析的影响。直接进样对仪器要求低，由于部分实验室不具备顶空进样器，该方法的应用也具普遍性。,进样方式选择需注意的几点：,对
7、于待测溶剂在溶解样品的溶剂中溶解度小（分配系数小）的情况下，例如三氯甲烷在水溶液中，采用顶空进样方式测得的灵敏度将大于直接进样；反之，例如甲醇与水互溶性好，直接进样的灵敏度将大于顶空进样。 测定二氯甲烷、三氯甲烷等卤代烃时，如果溶剂为水，直接进样容易造成FID检测器灭火，此时优选顶空进样。,无论是采用细口径或粗口径，均可选择不分流进样，提高灵敏度。当然，采用不分流进样也要考虑溶媒性质，挥发性太大的溶媒对色谱柱污染较大。 直接进样要考虑样品性质。 顶空进样体积可达到2ml气体，而直接进样只能1至3ul液体。,八、提高灵敏度,对于限度要求很严格的溶剂，或贵重样品取样量有限制时，或检测器对该溶剂灵敏
8、度低的情况下，采取一些措施提高灵敏度是方法成败的关键。 溶剂 温度 不分流进样 顶空瓶体积,利用盐析作用，即在水溶液中加入无机盐（硫酸钠）来改变挥发性组分的分配系数。常用高浓度，甚至用饱和浓度。盐析作用对极性组分的影响远大于对非极性组分的影响。例如在水溶液样品溶剂中加入0.01mol/L氯化钠溶液可使甲醇、乙醇灵敏度提高5倍（这种方法不常用）。,在有机溶液中加入水，可以减少有机物在有机相中的溶解度，增大其在顶空气体中的含量（常用）。例如采用FID检测器测定三氯甲烷，DMF为溶媒，顶空进样1ml气体，分流比5：1，限度浓度的对照品溶液检不出峰。改为：水为溶媒，三氯甲烷用少量乙醇溶解，水稀释至刻度
9、，顶空进样2ml气体，不分流进样，结果限度浓度的对照品溶液可检出很明显的色谱峰，灵敏度可达到限度的五十分之一。,九、改善分离度,程序升温 增大分流比,十、未知峰归属,对于供试品色谱图中出现的未知峰，应进行确认。首先分析是否为样品裂解峰，其次核实是否为应控制溶剂，可采用双柱定性方式。,十一、方法验证,方法的线性范围 主要由检测器的特性决定 检测限 由检测器、方法决定 回收率 加样回收率 重复性、中间精密度和重现性,药检所残留溶剂方法复核内容、常见问题及处理,一、复核内容,灵敏度 用申报方法检验所提供样品，比较结果,二、常见问题及处理措施,灵敏度低，限度溶液不出峰（源于检测器或方法） 分离度不好；
10、样品出峰并与溶剂峰不能达到基线分离；图谱基线不好杂峰多（柱温、色谱柱或进样方式） 溶媒不合适 供试品配制方法不当 较大未知峰应进行归属 复核结果不合格,方法评价,一、首先关注待测溶剂有哪些？,是否有下述三类溶剂： 卤代烃（三氯甲烷、四氯化碳） 氮/磷化合物（DMSO、DMF） 限度小的溶剂（苯、四氢呋喃等限度小于0.0X） 如果有上述物质应警惕方法的灵敏度是否能达 到检测限度要求。,二、是否使用了专属检测器？,FID：有机物 ECD：卤代烃（三氯甲烷、四氯化碳等） NPD：氮/磷化合物（DMF、DMSO等）同时具备上述三种检测器的实验室不多。请注意下述三点： 四氯化碳必须用ECD！ 不可用FI
11、D 填充柱检查前述三类物质，灵敏度低 使用ECD进行分离度试验应考虑非卤代烃！,三、溶媒,根据原料溶解性，溶媒是否能溶解样品？水、DMF、DMSO、不挥发酸碱溶液，不可使用盐酸液和氨水，顶空进样可选择在8090C加热能溶解样品的试剂。 其次溶媒是否能溶解待测溶剂？苯、甲苯、三氯甲烷等水溶性不好的溶剂，可先用少量乙醇或甲醇溶解待查溶剂再用水稀释。 前述三类溶剂如果顶空进样应选择K小的溶媒！ 不主张使用污染性大、毒性大的溶媒！,四、供试品制备,不可研磨样品，必须原态取样 不可超声、不能加热溶解样品 样品置顶空瓶中压盖后可以超声、加热 样品与对照品配制方法一致，避免基质效应 前述三类溶剂取样量尽可能大，至少0.1g/ml,五、进样方式,进样方式首选顶空，基线干净 卤代烃直接进样容易灭火,六、限度,ICH限度并不是最高要求 建议三类溶剂根据实际情况尽量提高限度 总量应控制,七、方法验证,方法的线性范围 主要由检测器的特性决定 检测限 由检测器、方法决定 回收率 加样回收率 重复性和重现性 前者容易实现，后者更重要，是方法验证必须考察的。,请提宝贵意见！,
