第六章克隆基因的表达

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1、第六章 克隆基因的表达,遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中心法则（central dogma）。,（一）、基因表达：,（二）克隆基因的表达：,外源基因在宿主细胞中表达。,外源基因,表达载体,重组载体,导入宿主细胞,在宿主细胞中 表达出蛋白质,提取蛋白,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞。,一、外源基因表达机制 P169,（一）外源基因的起始转录启动子和相关调控序列的作用增强子 衰减子等,（二）mRNA的延伸与稳定性 mRNA有效延伸、终止、稳定性是表达关键。 Prok. ：终止子结构： （不）依赖； 避免提前终止：衰减子；RNase缺失受体菌 Eur.：poly(A)掺入位点AAUAA；加工成熟

2、mRNA,（四）表达蛋白在细胞中的稳定性构建融合蛋白表达系统、构建分泌蛋白表达系统、构建包涵体表达系统、选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统.,（三）外源基因mRNA的有效翻译Prok.:SD序列，起始密码子，SD与密码 子的距离等 Euk.:5cap, 扫描序列GCC（A/G）CCAUGG,有效的ORF 。密码子使用频率。,（五）目的基因沉默（gene silencing）导入并整合到受体细胞核基因组上的外源基因，在当代或后代转基因个体中表达活性受到抑制的现象。 位置效应基因沉默：甲基化、异染色质区等 转录水平的基因沉默：启动子甲基化、基因异染色质化 转录后水平的基因沉默（PTGS）,二、外源

3、基因表达系统 P161,原核基因表达系统：大肠杆菌基因表达系统芽孢杆菌基因表达系统 真核基因表达系统：酵母基因表达系统昆虫基因表达系统植物细胞基因表达系统动物细胞基因表达系统,原核基因表达系统（大肠杆菌中表达系统）,（一）原核生物基因表达的特点 P153,1、原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原核细胞的启动子。表达调控主要在转录水平。,5、mRNA5端有SD序列，是mRNA结合到核糖体上必需的。,2、基因的表达是以操纵子为单位进行协同表达。,3、原核生物转录和翻译是偶联的。,4、基因不含内含子，真核生物mRNA在原核生物中表达不能成熟。,（二）大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征P1611、大

4、肠杆菌表达外源基因的优势 （1）遗传背景清楚。 全基因组测序，基因组结构简单，便于基因操作和分析。 （2）多数细胞内有质粒或噬菌体，便于构建相应表达载体， 目标基因表达水平高。 （3）代谢途径和基因表达调控机制比较清楚 （4）繁殖迅速、培养简单、操作方便 （5）被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,2、大肠杆菌表达外源基因的劣势 （1）缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 （2）内源性蛋白酶降解异源蛋白,（三）外源基因在大肠杆菌中表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数,表达载体的必要元件,1、启动子,TATAAT,TGTACA, 必须是一种强启动子,能使外源基因的蛋白产量达到细

5、胞总蛋白的10%-30%以上。,应是可诱导型的,便于表达毒性蛋白等。,应呈现低水平的基础转录,用温度或化学试剂诱导。,（1）最佳启动子必须具备的条件,常用启动子：,乳糖启动子Plac的可控性：乳糖启动子均为抗葡萄 糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5,（2） 乳糖启动子lac （Lac表达系统） P164,CAP,色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物阻遏， 转录呈基底状态。,（3）色氨酸启动子trp（Trp 表达系统）,IAA与Trp结构相似，可以与阻遏蛋白结合。 通过添加IAA可诱导Ptrp介导的目的基因的表达。,cI857:,调节基因cI ：选择一个温度敏感性的突变基因cI857，

6、克隆到载体上。,42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录,30oC时阻遏PL，外源基因不转录。,（4）PL和PR启动子（PL和 PR 表达系统）,从噬菌体得到的一类启动子, PL、PR是否转录与CI基因产物有关，决定了噬菌体是进入溶源循环还是溶菌循环。,2、终止子（terminator) P163,RNA 聚合酶滑过终止子继续转录质粒上邻近DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物。,常用：来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2串联终止子和T7噬菌体DNA上的T,强终止子保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源料和能量、不干扰正常的表达。,3、核糖体结合位点（RBS） 大肠杆菌中，翻译

7、起始时，首先是核糖体小亚基（30S）识别和结合到mRNA5端的翻译起始部位，该顺序称为核糖体结合位点（ribosome binding site,RBS）,四个特征要素：SD序列、翻译起始密码 子、SD序列与翻译起始密码子之间的距离及 碱基组成、基因编码区5端若干密码子的碱 基序列。,SD序列：位于翻译起始密码子上游的5-13个核 苷酸序列 5 UAAGGAGG 3。,S-D序列后面的4个碱基： 如是A（U）, 翻译效率最高；如是G（C）,效率只有50%或25%。,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD 序列与起始密码子之间的距离的影响,SD 与AUG 的距离保证 mRNA 在核糖体上定位，

8、使AUG 正好处于核糖体复合物的 P 位，这是翻译启动的前提条件。,起始密码子及其5端若干密码子的影响：90%以AUG为起始密码子，少数UUG、GUG。AUG右侧的几个密码碱基组成也有影响，不能与mRNA的5端非编码区形成茎环结构。,4. 生物体对密码子的偏爱性：简并密码子使用频率在不同生物或同一生物不 同蛋白质翻译时不同，具有偏爱性。,外源基因全合成：按照大肠杆菌密码子 的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适 宜的相应密码子。,同步表达相关tRNA编码基因：AGG、AGA大肠杆菌中相应tRNA丰度低，将这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。,外源基因密码子在大肠杆菌细胞中获得 最佳

9、表达：,pCP3:温度可诱导型的复制子 28：每个细胞拷贝数为60 42：拷贝数增至300-600个,5、质粒拷贝数：,同时,质粒载体的cI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活。PL启动子解除阻遏，外源基因大量表达。 由此：可同时控制质粒拷贝数和基因的表达,cI857,（四）大肠杆菌基因工程菌的构建策略,包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达,1、包涵体异源蛋白的表达 P175,外源基因在大肠杆菌高水平表达，表达量占细胞总蛋白20%以上时，倾向于形成包涵体。其中还包含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。,包涵体（Inc

10、lusion Bodies,IB）：某些生长 条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子， 它们致密地集聚在细胞内，这种不溶性的结构 称为包涵体。,包涵体形式的缺点：重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效 的变性、复性操作才能回收得到具有正确空间构象 的目标蛋白。,包涵体表达形式的优点：简化外源基因表达产物的分离操作：包涵体 难溶于水，密度大，易于分离。在一定程度上保持表达产物的结构稳定难于被 蛋白酶降解。,2、分泌型异源蛋白的表达将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。,优点：目的蛋白稳定性高、易于分离、末端完整不含Met。

11、 缺点：大肠杆菌分泌机制不健全，难于进行 分泌型表达， 但其表达率通常要比包涵体方式 低很多， 表达量少。,分泌机制,3、融合型异源蛋白的表达 P173,融合蛋白(fusion protein )：将外源基因与受 体菌自身的蛋白编码基因拼接在一起，并作为一个 开放型阅读框架进行表达，由这种杂合基因表达出 的蛋白质称为融合蛋白。,融合蛋白N端：受体菌蛋白C端： 外源蛋白,通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白,（1）受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化 （2）外源基因应装在受

12、体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子 （3）两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架 （4）两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺,融合蛋白表达质粒的构建原则：,表达率高：与受体蛋白共用一套完善的表达元件 溶解性好：由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多有水溶性。 需要回收：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获得目的蛋白。,融合形式表达目的蛋白优缺点：,稳定性高：折叠成正确构象，封闭蛋白酶切点。 易于分离：利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析。,优点：专一性强，回收率高（可达到85%以上），目的蛋白N端不含甲硫氨

13、酸。缺点：异源蛋白内部含有甲硫氨酸不能用此方法。,目的蛋白的回收：化学断裂法、酶促裂解法,化学断裂法：溴化氰（CNBr），断裂由甲硫氨酸羧基所参与形成的肽键。甲硫氨酸转化为高丝氨酸，下游肽段N端的第一位氨基酸残基保持不变。,酶促裂解法：单残基位点,特点：每种蛋白酶均有相应的断裂位点。 在残基处切开酰胺键形成不含上述残基的下游断裂肽段,外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基。,4、寡聚型异源蛋白的表达,将外源基因的多拷贝克隆在一个低拷贝质粒 上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达 的策略。即构建寡聚串联型异源蛋白表达载体。,特点： 目的蛋白高效表达：不提高质粒拷贝数，增加目 的基

14、因的拷贝数，可以改善表达量。 稳定表达小分子短肽：串联短肽有与蛋白质相似的长度及空间结构。 目的产物回收困难：寡聚短肽需要裂解和分离。,基本战略,5、整合型异源蛋白的表达,目的基因整合到宿主染色体，随受体细胞染色 体DNA的复制而复制。 目的基因表达稳定，但表达率低。,DNA体内重组的基本原理：同源序列依赖型,染色体DNA的两个同源区之间可发生同源重组， 其频率与细菌种类、同源程度、两个同源区之间 距离有关。,同源重组有整合和交换两种形式，前者只 需要一个断裂位点，后者有两个断裂位点。,三、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策,（一）工程菌遗传不稳定性的表现形式： 结构不稳定性：重组DNA分子上某

15、一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失。 分配不稳定性：整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）.,（二）工程菌遗传不稳定性的产生机制：,1、受体细胞中限制修饰系统对外源重组DNA分子降解 2、外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序。 3、重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配，这是重组质粒逃逸的基本原因 4、受体细胞内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排,（三）改善基因工程菌不稳定性的策略 1、改进载体受体系统，增大质粒稳定性：将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，

16、其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在不稳定区,2、施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素，药物和食品生产禁止加抗生素。根据载体上的营养缺陷型标记，筛选出含有质粒的受体细胞。,3、控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 4、优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成:限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定,练习题,大肠杆菌为什么能高效表达外源基因？ 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？ 什么是RBS位点，如何影响基因表达？ 什么是包涵体？其形成机理是什么？ 融合蛋白、寡聚型异源蛋白 基因工程菌的遗传不稳定性的主要机制是什么？如何提高基因工程菌的稳定性？,