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1、第二章 分子克隆工具酶,切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记 利用限制性内切酶切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能 获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质,任何物种都有 排除异物保护自身的防御机制免疫系统细菌的限制与修饰系统,限制性内切酶 修饰酶,第一节 限制性内切酶,Restriction endonuclease,一、限制与修饰 Restriction and modification,50年代初，发现 host controlled specificity 噬菌体具有代表性和普遍性 其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到
2、限制的现象。,1. 现象,EOP Efficiency of plate,pfu plaque forming unit,E. coli K,E. coli C,EOP=1,EOP=1,EOP=1,EOP=10-4,E.coli K E.coli B E.coli C,KBC,E.coli K E.coli B E.coli C,KBC,1,1,1,10-4,10-4,10-4,10-4,1,1,说明K和B菌株中存在一种限制系统 可排除外来的DNA 10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果甲基化：A N6甲基-腺膘呤C 5甲基-胞嘧啶,2. 限制酶的发现60年代，限制内切酶和限制酶的概念19
3、68年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶,需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等 有特定的识别位点 但没有特定的切割位点 切割位点远离识别位点1000bp以上,1970年 美国约翰霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 无细胞提取液可降解E.coli DNA 但不能降解自身DNA即HindII酶,5 .G T Py Pu A C. 3 3C A Pu Py T G. 5,G T C G A C G T T A A C G T C A A C G T T G A C,Y R,5 .G A A T
4、T C. 3 3C T T A A G. 5,EcoRI,3. 限制酶的命名,宿主 属名第一字母、种名头两个字母 菌株或型号 序号 罗马字HindII EcoRI,早前 加R, or M 菌株号和序号小写,1986年下半年 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌 3000种酶 200多特异性,Restriction Enzymes 3529Type I 49Type II 3470Type III 10Methyl-Directed 4,Enzymes: Restriction Enzymes 3601 Type I 51 Type II 3540 Type III 10 Met
5、hyl-Directed 4 Weirdo REs 1 Putative REs 631,Methylases 696 Type I 45 Type II 550 Type III 12 Orphan Methylases 89 Weirdo Methylases 0 Putative Methylases 900 Other Kinds of Enzymes: Homing Endonucleases 62 Nicking Enzymes 22 Control Proteins 33 Specificity Subunits 59,http:/ Availability:Restrictio
6、n Enzymes: 583 568Methylases: 18 17Homing Endonucleases: 6 5Nicking Enzymes: 7 8Distinct Type II RE specificities: 207 213,2002 2003,3. 限制与修饰系统的种类亚单位组成, 识别序列的种类, 是否需要辅助因子分三类(I, II ,III) 也有分四类，IIs类，即II 亚类,(1) type II 93%,识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割3-OH,5-P， 需Mg2+，相应的修饰酶需only SAM 识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列
7、但有少数酶识别更长的序列或简并序列切割位置因酶而异，有些是隔开的,R : 一般为同源二聚体, 反向结合作用在两条链M: 单体 DNA同时切割, M只作用新链,type IIs 占5% 识别位点非对称, 非间断 4-7bp 切割位点可能在20bp范围内。 R: 与 type II 具有相同的辅助因子要求 M: 通常由两个M来完成,各作用一条链,(2) type I 和 typeIIItype I (1%) 种类少 如 EcoR EcoB,R酶和M酶 各作为一个亚基存在于酶分子中即R基和M亚基，还有负责识别DNA序列的S亚基分别由hsdR，hsd M，hsdS基因编码属于同一操纵子（转录单位）,E
8、coK R2M2S EcoB R2M4S2,P1hsdRP2hsdMhsdS,M-,M- R- M-,R-M+突变 M+,S- R- M-,Gene type phenotype,M- R- M- 保全机制,识别位点EcoB TGA*(N)8TGCT A*EcoK AAC (N6)GTGCA* 甲基化位点 可能的甲基化位点切割位点1000bp以外, 无特异性,typeIII (1%)EcoP1 EcoP15识别 AGACC CAGCAG 切割 下游 24-26bp处,(3) I-prefix 和 PI-prefix,是否为R/M系统中的一个成员?,DNA,前RNA,mRNA,Intron,mR
9、NA,蛋白,活性蛋白,Inteins,前提蛋白,mRNA,蛋白,活性蛋白,Inteins,前提蛋白,Intron Inteins 相对性,I-CeuI 衣滴虫(Chlamydomonas eugametos) (unicellular green alga )叶绿体大rRNA基因的内含子,TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGA,3726bp识别位于19bp核心上 -12-+7,TAACGGTCCTAAGGTAGCG,PI-PspI极端嗜热菌Pyrococcus species GB-D 嗜热DNA聚合酶,内切酶是蛋白质体内拼接的产物， 在同一个多肽前体上同时产生聚合酶和该内切酶活
10、性,TGGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGT,65 30bp,The sequence degeneracy tolerated by this enzyme has not yet been determined,其它 I-PpoI PI-TliI PI-SceI (VDE),线粒体、叶绿体、核DNA、T偶数噬菌体,Enzymes: Restriction Enzymes 3601 Type I 51 Type II 3540 Type III 10 Methyl-Directed 4 Weirdo REs 1 Putative REs 631,Methylases 69
11、6 Type I 45 Type II 550 Type III 12 Orphan Methylases 89 Weirdo Methylases 0 Putative Methylases 900 Other Kinds of Enzymes: Homing Endonucleases 62 Nicking Enzymes 22 Control Proteins 33 Specificity Subunits 59,http:/ Availability:Restriction Enzymes: 583 568Methylases: 18 17Homing Endonucleases: 6
12、 5Nicking Enzymes: 7 8Distinct Type II RE specificities: 207 213,2002 2003,Homing endonucleases are double stranded DNases that have large, asymmetric recognition sites (12-40 base pairs) and coding sequences that are usually embedded in either introns or inteins. Introns are spliced out of precurso
13、r RNAs, while inteins are spliced out of precursor proteins. Homing endonucleases are named using conventions similar to those of restriction endonucleases with intron-encoded endonucleases containing the prefix, “I-“ and intein endonucleases containing the prefix, “PI-“.,Homing endonuclease recogni
14、tion sites are extremely rare. For example, an 18 base pair recognition sequence will occur only once in every 7x10ll base pairs of random sequence. This is equivalent to only one site in 20 mammalian-sized genomes. However, unlike standard restriction endonucleases, homing endonucleases tolerate some sequence degeneracy within their recognition sequence. As a result, their observed sequence specificity is typically in the range of 10-12 base pairs.,
