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1、基因工程的基本操作程序,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,苏云金芽孢杆菌,抗虫基因,棉花植株(有抗虫特性),基因工程的基本操作程序,（1）目的基因的获取 （2） （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测与鉴定,基因表达载体的构建,一、目的基因的获取,1、目的基因：,主要是编码蛋白质的结构基因,也可以是一些具有调控作用的因子,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后
2、，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的基因结构,有调控遗传信息表达的核苷酸序列,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,与RNA聚合酶结合位点,启动子、,终止子,一段有特殊结构的DNA片断，基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录启动子,一段有特殊结构的DNA片断，基因的尾端，使转录终止终止子,补：真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的
3、序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,一、目的基因的获取,1、目的基因：2、获取方法： （1）从基因文库中获取目的基因； （2）利用PCR技术扩增目的基因； （3）人工合成：通过DNA合成仪用化学方法直接合
4、成,主要是编码蛋白质的结构基因,也可以是一些具有调控作用的因子,（一）从基因文库中获取目的基因,1.什么叫基因文库？将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,基因组文库的构建模式图,注意：,基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,基因组文库与部分基因文库的关系,基因组文库和部分基因文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,思考：如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因
5、的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。,（二）利用PCR技术扩增目的基因,（二）利用PCR技术扩增目的基因,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,P
6、CR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本反应步骤,变性 90-95C,延伸 70-75C,退火 55-60C,PCR总结：,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,10080604020, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。,前提条件：_；原料：_、_ 、 _、 _。,原理：_,方式：
7、以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,DNA引物,热稳定DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,模板DNA,过程：,变性、退火、延伸三步曲,变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA 退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形
8、成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,思考？,1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次， 理论上至少需要几个引物？,2（2n-1）(n为循环次数),（24-1）2=30,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过
9、化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,（三）化学方法人工合成目的基因,人工合成,(基因比较小),DNA合成仪,从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 利用化学方法人工合成,归纳：获取目的基因的方法,用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。用_切断目的基因，使其产生_。,将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA连接酶,1.过程:,二、构建表达载体, 核心,质粒,DNA分子,限制酶处理,两
10、个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口 两个黏性末端,复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因,过程:,2.基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。,科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，
11、结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。,（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；,（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方
12、向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；,（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,3.基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,调节基 因,操纵基 因,结构基因,RNA聚合酶,半乳糖苷酶,酶,酶,启动子,RNA聚合酶,启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。,思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？,（1）生物之间进行基因交流，只有使用受
13、体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达； （2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。,思考2：终止子的作用是什么？终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。,是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,思考3：标记基因有什么作用？,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。,注意,用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。,启动子、终止子对于目的基
14、因表达必不可少。,目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,基因工程技术路线,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,（一）转化：,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,（二）方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法,（1）农杆菌转化法,特点
15、：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（2）基因枪法,适用于单子叶植物,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用于被子植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,2.将目的基因导入动物细胞,（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）,
