脆性x综合征诊断与治疗新进展

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1、脆性X综合征诊断与治疗新进展 脆性X综合征( fragile X syndrome ,FXS)是引 起先天性智力低下的常见疾病，新生儿发生 率为0.40.67，占X连锁智力低下病人的 1/21/3。男性发病率约为1/4000，女性发病 率约为1/60001/8000，前突变的携带者在男 性中约为1/800，而在女性中则高达 1/1001/200。 FXS发病率仅次于先天愚型，占智力低下的 2%,估计20IQ水平3055之间的男性患有该 病。给家庭和社会带来沉重的负担。同时 FXS具有家族遗传性且临床表现复杂。为临 床诊断和治疗带来了极大的困难。 FXS是一种单基因遗传性疾病 ，是由于 Xq2.

2、7.3的脆X智力低下1 (fragile X mental retardation 1 ,FMR1)基因突变导致其5端 (CGG)n三核苷酸重复序列异常扩增，当扩增 达到一定数目后便会出现该基因异常甲基化, 使FMR1基因的转录功能降低,导致其编码的 脆X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein ,FMRP) 减少,引起相应的 症状。 FXS临床症状常表现为不同程度的智力低下 和发育延迟，男性患者平均IQ在中度以下， 20%男性患者IQ水平在30-50之间。女性患者 受累较男性为轻，智力低下常不严重，在轻 度至临界范围。青春期前的男性患者表现多 样

3、：逃避行为，逃避注视、孤僻症、过度兴 奋、注意力不集中或多动症、动作刻板、睡 眠紊乱、语言发育也常受影响，多有轻度交 流障碍； 躯体特征在不同年龄、不同个体中差异较大 ，成年男性患者可有特殊面容：脸型狭长、 大耳朵、眉弓及下颌突出，上述表现可随年 龄的增加而愈加明显。但有时即使是受累严 重的典型未成年男性患者其面部特征也可表 现轻微，往往难以引起人们的注意。1 FXS临床诊断方法新进展 FXS 是由于FMR-1基因5端(CGG) n 重复系 列大量扩展的结果，如果(CGG) n重复上升 到230 至1000 次之间，就会产生FXS。目前 对于脆性X综合征的诊断主要依赖于实验室检 查。 根据20

4、05年最新ACMG指南对于以下几种临床情况应进行分 子生物学检测： 智力缺陷, 发育迟缓, 性格孤僻, 行为体征疑为脆性X综合 征者； 具有不明原因的智力障碍者； 具有脆性X综合征家族史者； 具有脆性X综合征或不明原因智力缺陷家族史，生育前进 行遗传咨询者； 脆性X综合征携带者母亲的胎儿； 卵胞刺激素升高并伴有卵巢早衰的妇女，特别是具有不明 原因智力缺陷家族史者； 未明原因的新发震颤/小脑性共济失调患者，特别是伴有不 明原因的智力缺陷家族史者。 FXS实验室诊断方法有细胞遗传学、 Southern印迹杂交、聚合酶链反应（PCR） 、 RT-PCR和免疫组化分析11细胞遗传学检测 该方法至尽今已

5、发展成熟。诊断的重要指标：培养中期细胞 染色体Xq2.7显示脆性位点大于4%为阳性。甲氨蝶呤或5-氟 脱氧尿苷可诱导出脆性位点提高显现率，与原位杂交荧光技 术结合可分析检测数量和结构的异常并提高图谱分辨率至10 万bp。fra(X)并不是在所有的中期细胞中都能找到，标本来 源于外周淋巴细胞、羊水、绒毛或脐血。一般智力低下男性 患者fra(X)的表达率为10%30%。年龄较大、表型正常的女 性携带者可不表达，表达常低于5%。故不用于对表型正常 的女性携带者的诊断。该法费时费力、检出率低于50%，且 只能对男性患者及部分女性患者做出诊断，不能检出不全显 性患者及女性杂合子，对于男性患者也易产生假阴

6、性。所以 应用较局限。 12 Southern印迹杂交法 FXS5端的（CGG）n的异常扩增及CpG岛异 常甲基化使其上的特异性酶切位点消失，需 用限制性核酸内切酶识别、结合并切割特异 性序列，产生不同长度的核酸片段，用于诊 断。根据待测片段的大小选择合适内切酶。 全突变使用HindIII或EcoRI可得到很强的杂交 信号，不完全突变需使用PstI方可产生清晰 的高分辨条带。 目前认为应用较远侧探针（StB12.3）对双酶解（ 如EcoRI/EagI）DNA样本进行杂交，可检出全部前 突变和全突变等位基因及嵌合体状态，同时可了解 甲基化状态，是最可靠的诊断方法。Southern印迹 杂交法缺点

7、为：需要DNA样品多、需要同位素标记 、操作复杂、费用大、耗时长、不易推广；若酶解 不完全会产生杂交带，可产生错误诊断；较难鉴别 (CGG)n大的正常个体和小的前突变个体；有较大的 漏诊率和约5 %的误诊率。13聚合酶链反应技术为目前快速、准确检测（CGG）n重复的方法，传统的聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction,PCR)技术可以检测正常个体及小片段的前 突变等位基因的（CGG）n重复数。对于较长片段的前突变及全突变患 者，由于高的GC含量，序列内部易于形成发夹结构不易扩增，可利用甲 基化敏感性聚合酶链反应（methylation sensitive Polyme

8、rase Chain Reaction ;ms-PCR），引入特异性的引物使扩增不出来的等位基因产生 smear条带，通过不同的探针标记引物，利用毛细管电泳法检测PCR扩 增产物，可以准确的检测（CGG）n重复数。结合普通PCR及ms-PCR 技术，可以鉴别正常个体、前突变、全突变男性及全突变女性。由于 PCR技术优先扩增较小片段的等位基因，因此对于呈嵌合型的患者，也 会产生PCR扩增产物，易于产生假阴性。PCR技术是快速筛查脆性X综 合征的基因诊断方案。难以扩增出全突变的等位基因，因此限制了它对 于脆性X综合征患者临床诊断方面的应用，PCR技术和Sothern blot技术 的联合应用，可以

9、弥补相互之间的缺陷。14 逆转录聚合酶链反应技术 绝大多数FXS征男性患者无FMR1基因的表达，而 女性患者的FMR1基因是杂合的，FMR1基因表达降 低，但可检测到。所以RT-PCR在男性患者、缺失 或点突变的个体是检测不到扩增引物，而对于正常 个体、前突变及女性可以获得扩增条带。Hmadcha A等用RT-PCR方法检测该FMR1基因的表达。 Wu LQ等设计合成了2对特异性引物检测位于X 染色体 上的HPRT基因的转录产物，通过巢式PCR技术对 cDNA进行扩增、检测。有助于FRAX患者的诊断及 表型的预测，对于遗传咨询有较大的帮助，不能鉴 别女性患者及检测前突变状态，从而应用有限。 1

10、5 FMRP免疫组化分析 应用此方法检测FMRP的表达量。可诊断由于（CGG）n的 扩增导致的脆性X综合征患者，及检出由于缺失、点突变导 致FMR1基因不表达的患者，同时简便、经济、快速，适用 于群体筛查，其敏感性100%，特异性97.5%。但由于女性 患者体内有一定比例的活性X染色体，且具有全突变的等位 基因多位于失活的X染色体，大多数淋巴细胞的FMRP降低 不明显，易于形成假阴性，且由于前突变等位基因能正常转 录，FMRP表达多在正常范围内，亦不适用于前突变携带者 的筛查，因此仅适用于男性患者的诊断。Rife M等比较了 PCR和FMRP免疫组化检测在人群筛检方面的差别，认为 PCR是最合

11、适、方便、省时的方法。但对于那些PCR检测失 败的患者，推荐应用该方法。16 产前诊断 2005年ACMG指南建议妊娠10-12周的FXS携 带者妇女用绒毛膜绒毛标本，可显示前突变 。CVS细胞不同于外周血细胞，它不存在甲 基化的X染色体失活，全突变的FMR1基因5- UTR的三核苷酸（CGG）n重复序列甲基化 也可有可无。利用FMR1基因甲基化和X染色 体失活诊断全突变有失准确性。若CVS结果 阳性，应于妊娠15周抽取羊水细胞排除全突 变和嵌合体状态。2 FXS治疗新进展 目前无有效的治疗方法。近来在FXS的治疗 中最明显的进步就是在动物实验中认识到了 FXS潜在的缺陷和发展了的可能的治疗。

12、 2、1 一般治疗 叶酸可以“修复”FXS细胞传代时的脆性位点,使FMR 基因表达功能正常的FMRP,改善智力状况。同时还 可予维生素C、维生素E、微量元素锌、硒等。智低 者营养脑细胞,茴拉西坦、吡拉西坦、胞二磷胆碱等 可改善症状。癫痫可按发作类型正规抗癫痫治疗。 中医中药疗法,应用加味六味地黄丸培补肾元,针灸 推拿促进智力发育,改善小儿痴呆。治疗效果与患儿 年龄和原发神经疾病有关。16岁智低和痴呆患儿年 龄较大效果不佳,癫痫患儿服药不规范控制不良。 2、2真对于FMRP表达减少的治疗 2、2、1 针对FMR1的基因治疗 FMR1突变导致FMRP减少引起FXS的发生，FMRP是一种 mRNA绑

13、定蛋白，其在中枢mRNA 翻译、转运及靶向作用中 起重要作用。FMRP负相调控mRNA翻译为蛋白质.Rattazzi 等提出基因治疗的可能性，通过给Fmr1 KO小鼠注射一种小 的、可扩散的带有FMR1 cDNA基因的腺伴随病毒，此病毒 包含 5启动子区和 3 非翻译区的基因，通过渗透作用通过 血脑屏障，从而传递Fmr1 cDNA进入大脑。 Musumeci 等 发现在Fmr1 KO小鼠予以人类FMR1基因和FMR1 cDNA治 疗，和野生型FMR1小鼠比较听源性癫痫的易感性，由于听 源性癫痫具有年龄易感性，所以在不同的年龄检测，发现听 源性癫痫在6 个月大的小鼠可以完全治愈 ，而在成年小鼠仅

14、 可部分治愈。2、2、2 FMRP蛋白的添加治疗 最近文献报道：蛋白转导领域能够转导大分 子蛋白进入细胞甚至进入大脑。来自人免疫 缺陷症病毒的A蛋白：TatFMRP融合蛋白， 利用腹腔注射可以传递大分子进入细胞并通 过血-脑屏障。置入FXS成纤维细胞和FmrKO 小鼠的初级培养物神经元，FMRP蛋白的摄 取效率和水平在神经元比期望的要低的多。 另外，FMRP蛋白是否有毒被质疑 。同时运 用免疫组织化学发现运用转导蛋白介导的 FMRP在成纤维细胞中摄取的效率和速率比 预想的低，神经元摄取率更低。同时FMRP 的浓度也需要严格控制，超过生理水平或较 高水平可能导致mRNAs的不适当的翻译， FMR

15、P转基因的过度表达在FmrKO小鼠导致 严重的行为异常甚至有害的作用。同时 FMRP精确的表达需要技术的引入。 现在基因治疗可能不是FXS治疗最好的方法.人类脆 性X染色体相关基因FMR基因包括FXR1基因和 FXR2基因。分别定位于X .q27.3，3q28和17p13.1 。它们分别翻译蛋白FMRP, FXR1P和 FXR2P，这 三种蛋白主要存在于细胞浆中在脊椎动物中表达广 泛，FMRP在大脑和睾丸中表达最高，FXR1P主要 在于横纹肌表达，但未发现FMRP和 FXR2P在横纹 肌中表达，至今还没有发现FXR1和FXR2与任何病 理缺陷相关。但由于由于FMR1基因突变导致其编 码的FMR

16、P蛋白减少导致FXS，同时FXR1P和 FXR2P是否会在由于FMR1突变导致的FXS中起到 补偿作用，至少部分补偿，至今还是一个未知话题 。2、3 L型Ca2+通道阻滞剂的治疗作用 FMRP蛋白与mRNAs的转录和翻译有关，靶mRNAs水平在 FXS脑区没有改变，但是由靶mRNAs转录的蛋白L-型Ca2+ 通道亚单位和 MAP1B在特殊脑区下调，提示FXS靶编码蛋 白的表达有缺陷。L-型Ca2+通道参加记忆突触的形成。 2003年Veng等发现Ca2+通过L-型电压敏感Ca2+通道增加 造成成年小鼠的海马CA1 区的Ca2+增加，通过L-型Ca2+通 道的Ca2+注入可能对记忆的形成有害。利用L-型电压敏感 Ca2+通道拮抗剂尼莫地平长期治疗与年龄相关的操作记忆 缺陷和海马a蛋白的增高，尼莫地平可改善年龄相关的操作 记忆缺陷和降低海马a蛋白的表达。海马CA1区与年龄相关 的操作记忆减退及a蛋白的增加与记忆缺陷相关。其中年