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1、分子生物学实验实验四 原核细细胞质质粒DNA的提取第3周分子生物学实验仪实验仪 器设备简设备简 介和 实验实验 有关内容介绍绍 第4周从植物组织组织 提取DNA第5周从动动物组织组织 提取DNA第7周原核细细胞质质粒DNA的提取第8周核酸的琼琼脂糖凝胶电电泳第9周紫外吸收测测定核酸含量第10周限制性内切酶酶切质质粒DNA 第11周凝胶电电泳回收和纯纯化DNA片段第12周细细菌感受态态的制备备第13周质质粒DNA的转转化第14周目的基因的PCR扩扩增与检测检测第15周原核蛋白质质SDS-PAGE电电泳第17周考试试一、实验原理由溶菌酶破坏细胞壁的糖肽层再经经EDTA破坏带有质粒的细菌外膜系统，再
2、经去垢剂SDS变性作用，使细胞膜蛋白质变性裂解而使胞内DNA全部释放出来。质粒DNA具有较强的耐剪切和耐碱特性（pH12.012.6），且恢复中性后又呈天然构型，而染色体DNA仍处于变性状态，用乙酸钾沉淀变性的蛋白质和染色体，再用乙醇沉淀上清液中的质粒DNA，便可得到含染色体DNA较少的质粒DNA粗提物，可直接用于酶切和转化实验。二、材料与设备E.coli 菌株；冷冻离心机，高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台三、试剂与配制1)质粒DNA碱裂解法试剂： 溶液I： 葡萄糖 50 mmol/LEDTANa2 10 mmol/LTris-HCl （pH8.0） 25 mmol/L溶液II：（临用时新配
3、制）NaOH 0.2 mol/LSDS（w/v） 1%0.4mol/L NaOH 和2% SDS（w/v）对半混匀即可。溶液III：5 mol/L 醋酸钾 60 mL冰醋酸 11.5 mLDDW 28.5 mL注意：溶液I、III都须高压灭菌。2)氯仿:异戊醇=24:1 3)无水乙醇；70%乙醇；异丙醇 4)TE（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA 四、实验步骤：（1）取菌液1.0mL, 7000 rpm离心5min,弃上清。（2）加入预冷的100l 溶液I。震荡混匀。室温放置5min。（3）加入200l溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管3-5
4、次（不要剧烈震荡）, 冰浴放置5min。（4）加入预冷的150l 溶液III。温和震荡混匀，冰浴3min。（5）4 12000rpm离心5min。（6）取上清至另一干净的EP离心管中，加入400l 氯仿:异戊醇，混匀。4 12000rpm离心5min。（7）轻轻取上清至另一干净的EP离心管中，加入800l无水乙醇或0.6倍体积异丙醇，充分混匀后，室温静置沉淀5min。（8）4 12000rpm离心5min，弃上清。（9）用500l 70%的乙醇漂洗沉淀2-3次，12000rpm离心5min。（10）沉淀物自然干燥后加入30l 含RNAase的TE(pH8.0)，以溶解质粒DNA。（11）电泳检测实验结果。五、作业：1、细菌质粒DNA的提取过程中如何去除细菌基因组DNA的污染？2、溶液I、溶液II和溶液III的作用分别是什么？微 量 移 液 器使用对应的吸头（枪头）、确认样品的加入。台式离心机水浴锅
