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1、第二章 基因操作的主要技术原理 基因操作技术主要包括基因操作技术主要包括（1 1）DNADNA分子的切割、连接、转化分子的切割、连接、转化（2 2）核酸分子杂交，凝胶电泳以及序列分析，）核酸分子杂交，凝胶电泳以及序列分析， 基因的人工合成，基因的人工合成，PCRPCR扩增等扩增等 第一节第一节 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 第二节第二节 核酸分子杂交核酸分子杂交 第三节第三节 细菌的转化细菌的转化 第四节第四节 DNADNA序列分析序列分析 第五节第五节 基因扩增基因扩增 第六节第六节 基因的定点诱变基因的定点诱变 第七节第七节 蛋白质与蛋白质与DNADNA相互作用的研究方法相互作用的研究方法
2、第一节第一节 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳一、核酸的凝胶电泳一、核酸的凝胶电泳( (AgaroseAgarose n循环次数。 Rate of PCR 2n No1 Y1 Nf2nInitial DNA8421Number of DNA molecules靶序列Primer 1Primer 253553533靶序列Primer 1 Primer 253553533Taq DNA Polymerase温度（温度（ ）时间（时间（minmin ）9494727260609494变性（变性（ 1min1min）60 60 退火退火 （1min1min）72 72 延伸延伸（ 1.5min1.5min
3、）循环循环1 1 循环循环2 2 循环循环3 3PCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCRPCR反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNA变性、引物退火变性、引物退火 和反应延伸和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是三个步骤完成的。图中设定的反应参数是9494变变 性性1min1min， 6060退火退火1min1min， 7272延伸延伸1.5min1.5min。如此周而复始如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。Typical PCR Thermal ProfileTypi
4、cal PCR Thermal Profile*This cycle is normally included in a PCR assay in order to *This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full lengthachieve it
5、s full lengthReaction Condition for a Typical PCR AssayReaction Condition for a Typical PCR Assay2 2、Some DNA Polymerases Used in PCRSome DNA Polymerases Used in PCR Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发 现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。 Taq polymerase，则是于1976年从温泉中的细菌（Thermu
6、s aquaticus ）分离出来的 。 pfupfu，从海洋附近火山口生活的细菌中发现，比，从海洋附近火山口生活的细菌中发现，比TaqTaq具有更高的扩增准确性具有更高的扩增准确性 ，具有，具有3-53-5外切酶活力，可以修复错配。外切酶活力，可以修复错配。 KlenowKlenow fragment of fragment of E. ColiE. Coli 最适反应温度最适反应温度3737，容易使，容易使DNADNA引物与模引物与模板之间形成非专一的碱基错配，或容易受板之间形成非专一的碱基错配，或容易受 某些某些DNADNA二级结构的影响，在扩增结果中二级结构的影响，在扩增结果中产生非特
7、异的产生非特异的DNADNA条带，降低特异性。条带，降低特异性。 在变性温度下会失活，需要不断添加酶在变性温度下会失活，需要不断添加酶727294945555PCRPCR循环循环 Taq DNA聚合酶水生栖热菌(Thermus aquaticus, Taq)的DNA聚合酶n 53DNA聚合酶活性n 无35外切酶活性，35轮0.25%错配，与原始模板有差别；最适聚合酶温度72，连续保温30min具有相当活力，选择 72延伸n 半衰期：92.5 130min 95 40min 97.5 56minn 变性温度：95使其在整个扩增循环中保持足够活性Characteristics of Charact
8、eristics of TaqTaq Polymerase Polymerase 1-2kb/min pfu DNA 聚合酶 耐热 53DNA聚合酶活性 35外切酶活性 精确度：pfu Taq但pfu扩增效率通常比Taq酶略差 文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果 3、引物人工合成短寡核苷酸20bp-25bpTm=55-60，Tm值要相近 ，每条10-50pmol /100l 设计原则： （1）引物长度n 1530个碱基n引物太短，可能同非靶序列杂交，产生非特异条带n例如：长8bp引物，平均每隔4865536个bp会出现一个结合 位点，在3109bp的基因组中会有可能43000个结合点；长
9、17bp 的引物，平均每隔4171.71011个bp会出现一个结合位点，在 3109bp的基因组中会有可能1个结合点5GCTCCATGACCCAG-GCGATCTTTTGAGTCCAA 3 3CGCTAGAAAACTCAGGTT 5下游P上游P5GCTCCATGACCCAG35-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3正链53负链35（2）靠近5上游Primer与双链DNA正链相同，3下游 Primer与双链DNA正链互补，与负链相同。 （2 2）Primer Primer 本身不要出现内部互补序列本身不要出现内部互补序列形成形成looploop环，内部二级结构环，内部二级结构如：
10、如： GGGTGGGTCGATTCCTCGATTCCTACCCACCCATGCATGC（3 3）注意减少注意减少PrimerPrimer间互补序列间互补序列导致导致2 2个个PrimerPrimer形成形成dimerdimer 一般不要超过一般不要超过3 3个互补个互补bpbp如：如：CCCATGC ATGGAGTC CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : : : : : : : : : :GGGTCTA TCAGTAAGC GGGTCTA TCAGTAAGC n n修饰修饰如：如：3232P P、生物素、荧光素，不影响其效果生物素、荧光素，不影响其效果n n突变：突变：
11、A AGCTCCATGACCCAGGCTCCATGACCCAG 5 5C CGCTCCATGACCCAGGCTCCATGACCCAG 3 3n n注意：注意：绝不可以在绝不可以在33端进行上述改造端进行上述改造DNADNA聚合酶是聚合酶是5353聚合，若聚合，若33端改造端改造不能互不能互 补补不能延伸不能延伸 （4 4）Primer 5Primer 5未端可修饰、突变未端可修饰、突变（5 5）primer 5primer 5端增加碱基端增加碱基 内切酶识别点：内切酶识别点：（GG）GAATTCGAATTC GCTCCATGACCCAGGCTCCATGACCCAG 保护保护bpbp作用：作用：
12、n n对对PCRPCR产物产物cloningcloning有很大好处有很大好处n n便于内切酶消化，不同内切酶需保护便于内切酶消化，不同内切酶需保护bPbP数量不同数量不同EcoRIEcoRI 1 1 BglIIBglII 2-3 2-3XbaIXbaI 2-3 Hind 2-3 Hind 3 3BamHIBamHI 2-3 2-3 PstIPstI 4 4XhoIXhoI 4 4 NotINotI 10 10如果所用保护如果所用保护bpbp数量不合适数量不合适影响内切酶消化影响内切酶消化影响下步克隆，若影响下步克隆，若未切开，连接不上。未切开，连接不上。 ATGATG起始密码起始密码 TAA
13、TAA、TAGTAG、TGATGA终止密码终止密码如：如：可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有 膜外区。膜外区。（6 6）简并引物）简并引物 由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间有一个由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间有一个 或数个核苷酸的差异。或数个核苷酸的差异。 需要注意变性温度，以避免引物与模板的错配，需要注意变性温度，以避免引物与模板的错配， 可以采用可以采用“ “热起始热起始” ”法：把混合物加热到法：把混合物加热到7272，然，然 后加入后加入TaqTaq DNA DNA聚合酶。聚合酶。 热启动热启动PCRPCR：把把PCRPCR混合物在显著低于混合物在显著低于TmTm的温度下哪怕的温度下哪怕做短暂的保温也可能产生引物二聚体和非做短暂的保温也可能产生引物二聚体和非 特异性配对，采用热启动特异性配对，采用热启动PCRPCR，在第一个，在第一个 循环中等温度升高到超过反应物的循环中等温度升高到超过反应物的TmTm后再后再加入酶，减少错配。加入酶，减少错配。（7 7）嵌套引物）嵌套引物 为了尽可能的减少非靶序列的扩增为了尽可能的减少非靶序列的扩增 利用第一次利用第一次PCRPCR扩增的产物做为第二次扩扩增的产物
