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1、植物组织培养作者摘要关键字植物组织培养既是一种基础性研究，又是一种极具普及意义的生物技术。它具有耗费母株材料少，繁殖速度快，繁殖率较高，用嫩茎组织培养法可以得到无病毒植株，减轻病毒对花卉的影响，以及定向培养植物优良品种等方面的优势。植物组织培养的基础是植物细胞的全能性理论，它从诞生到现在经历了4 个时期，即理论准备和实验开创期 ;研究发展时期;生产应用时期;“克隆”生物时期(肖杰， 2004)。如今植物组织培养技术已经成为农林业中极具普及意义的生物技术之一，而芍药组织培养目前处于理论准备和实验开创期。但是对芍药进行组织培养，应用植物激素控制分化过程及分化数量可达到繁殖目的，并节省人力物力，是芍
2、药批量生产的最佳方法(胡映泉， 2003)。近年来中外学者对芍药的组织培养进行了大量的研究工作，主要集中在以种子为外植体的组织培养方面(BrukhinvB ，一994;KimYS ， 1995 年;BuchheimJAT ， 1994)，也利用花药 (LeeB， 1992)培养诱导形成单倍体植株或胚状体。众所周知，常规方法育种周期长、见效慢，极大地限制了新品种的研制与开发。而利用植物组织培养中的花粉、花药进行单倍体育种结合温室育苗技术，可以大大缩短育种年限，实现早期选择、提高选择效率。利用体细胞来培育新品种已成为当今育种领域的趋势之一，对于无法结实的多倍体花卉来说，采用组织培养技术则能为其提供
3、一条具体的繁殖途径。对于那些产生芽变的种类来说，由于变异部位太小，难以进行传统的扦插或嫁接繁殖，无法使这些新出现的宝贵种质保留下来;如果将发生变异的细胞进行分离，并培养成苗则可以选育出许多新的品种，这无疑为花卉新品种的培育提供了广阔的空间。影响外植体污染的因素较多，除要求操作人员严格按照无菌操作程序操作外，还与外植体的种类、取材季节、预处理方法、消毒方法、杀菌剂的使用等因素有关。在植物组织培养中，造成污染的病原主要是霉菌、细菌和酵母菌三大类，霉菌和酵母菌引起的污染很容易观察到，初代培养就能在外植体周围或培养基表面形成明显的菌落，而细菌污染则存在一定的潜伏期。如果外植体培养3 一 5d 内未表现
4、污染症状，而以后不断出现污染现象，表明污染主要由内生菌引起(Leifert ，1990;柴向华，周俊辉， 2003)。抗生素抑菌在动物细胞培养中早己被广泛应用，在植物组织培养中尚处于开始阶段。近年随着植物基因工程的开展，转基因过程中的除菌和抑菌越来越离不开抗菌素所以使用抗菌素逐渐成为植物组织培养中的灭菌技术之一。在抗菌素的使用上，Falkiner(1990 年)提出 3 个条件，即必须弄清楚要抑制菌的种类，使用的抗生素是否对培养的植物组织有不良影响，还要确立抗生素的使用浓度、处理时间的长短。因没有一种抗生素能对所有引起污染的微生物都有效，所以抗生素也不能完全代替灭菌技术，最好加在培养基中，作为
5、一种辅助防止污染的措施。植物组织培养中外植体种类的选择以污染少、易启动为原则。带芽的外植体，如茎尖、侧芽、带芽茎段，培养成功率高，变异率小，容易保持材料的优良特性。其中，顶芽芽体饱满，营养丰富，侧芽较瘦弱，所以顶芽启动快，分化率高;继代培养中由于顶端优势的作用，腋芽的生长受到抑制，生长势弱于带芽茎段。因此，用顶芽作为外植体时，培养基中常加入细胞分裂素打破顶端优势作用，促进腋芽大量萌发，提高繁殖系数 (裘文达， 1986)。据分析，外植体取材的季节以材料积累了较丰富的营养和内源激素为佳， 大多在材料休眠末期或萌动前期取材污染率低，因为此时病菌还没活跃起来， 材料抵抗病菌能力也比较强(邓小梅，20
6、04);但是大多数生长末期或休眠期取材的外植体， 在培养中反应迟钝， 不能培养成功， 所以就萌发情况而言，在其生长开始的季节取材较好(谭文澄， 2001)。如叶子花腋芽培养，在11月至次年 2 月间采样，侧芽萌发极为迟缓， 而在 3 月至 8 月间取材， 萌发数及速度均得到满意结果 ;马铃薯组织培养中的器官形成也受到季节的影响，在 12 月和4 月取材的外植体具有强烈的再生能力，而在2 一 3 月或 5 一 n 月取材，则很少能够再生愈伤组织培养利用组织培养技术繁殖植物， 除了以芽作为外植体产生大量丛生芽的方式外，还可以通过愈伤组织培养， 诱导产生不定芽的途径进行。 对于芍药而言， 以芽为外植
7、体的快速繁殖途径不仅严重损伤亲本植株，造成母株生活力和观赏价值的下降，而且由于受芍药自身生长发育特点的影响，材料来源有限， 取材时间也受到限制，再者地下芽污染严重， 造成材料的巨大浪费。 通过愈伤组织培养途径形成新植株的过程需要经过分生组织脱分化和愈伤组织再分化，所以培养难度相对较大，但是它可以克服芍药组织培养快繁中以芽为外植体污染严重，难于建立无菌培养体系等问题，同时为芍药的遗传转化及新品种培育等方面的研究提供有效途径。我国野生药用植物种质资源非常丰富，据统计在5000 种以上。由于传统的中草药的获取消耗大量的野生植物资源，加之自然环境的日趋恶化， 使其再生能力大大下降， 致使许多药用植物资
8、源严重匾乏，尤其是那些生长缓慢、 产量较低的贵重药用植物更是供不应求。在已出版的中国植物红皮书第一卷中，共收载了 388 种国产珍稀濒危野生植物，其中有药用价值的约100 余种，包括人参、天麻、黄茂、杜仲、厚朴、巴戟天、平贝母、肉从蓉等许多名贵药用植物121。为了解决药用植物的供需矛盾，人们多采用人工栽培的方法扩大药源。但在人工栽培的药用植物中， 有许多名贵药材如人参、 黄连的生产周期长， 以常规方法育种、育苗，需要花费很长的时间;另一些药用植物如贝母、番红花等，因繁殖系数小、耗种量大，导致发展速度很慢且生产成本增加;还有一些药用植物如地黄、太子参等，则因病毒危害导致退化，严重影响了产量和品质
9、。因此，积极研究药用植物资源的再生技术， 使有限的资源为人类持续利用已成为鱼待解决的问题。目前药用植物组织培养的应用主要有两个方面:一是利用试管微繁生产大量种苗以满足药用植物人工栽培的需要:二是通过愈伤组织或悬浮细胞的大量培养，从细胞或培养基直接提取药物，或通过生物转化、酶促反应生产药物成分。利用植物组织培养生产药物，已发展成为植物组织培养在生产应用的主流之一，这是由于植物产生的药物在微生物中很少发现，且化学合成难与天然药物竞争，仅世纪 90 年代以来的植物药用有效成分国际专利就达50 多项，其中多为抗病毒、抗癌化合物 131。药用植物因缺乏环境保护，资源短缺及栽培技术问题等原因，使来源于植物
10、的药物供不应求。植物组织培养比露地栽培有很多优点: (l)占地少，周期短，不受地区和季节的限制，便于开展大规模的生产; (2)无污染，无重金属积累，产物疏松，对于进行有用成分的生产和提取便利; (3)通过对细胞生长的自动控制和代谢过程的合理调节，有助于提高有用物质的含量，并且避免了利用天然药用植物产生的无用部位的浪费; (4)利用高产细胞株的筛选和复壮技术，可获得有用物质几倍甚至几十倍于原植株的培养物 ; (5)对培养物的诱导或因其自发突变，可产生一些原植株所没有的生理活性物质; (6)利用植物细胞培养，可将一些较初级的化合物转化成医药上更为有效、高值的药物 ; (7)组织培养中的细胞生产速度
11、要比植物的正常速度快，接近于分生细胞的生长速度，使得在较短的时间内获取大量的组织或细胞并从中自接提取和生产药物成为可能。用组织培养得到的离体无性系可以加快繁殖植物并使之脱病复状，当感染病毒的植物在高于正常温度下生长， 这种植物可不受伤害而病毒的增殖则部分或完全受到抑制。为此可以切取更大的茎尖作为外植体进行组织培养，这种外植体不仅易于操作而且生长更快。 分化组织、茎尖和芽培养几乎为多种植物的所有基因型(品种)提供了有效的快速繁殖方法。由于这种技术的无菌操作条件，因此可以有效地大量扩增没有病毒感染的植物品系。例如苹果如被病毒感染后一般要减产14%一 45%，而且品质恶化后不耐贮藏，如采用无毒化和快
12、速繁殖，有的试验从一个茎尖一年中可以得到2 万株以上种苗，减少大量损伤，已推广3 万亩以上。1.4.3.1.1观赏植物很多种具有观赏性的植物已成功地得到了无性系繁殖，而且范围也日益扩增。 通过人工无性系繁殖，仅具有观赏性的植物如菊花大量上市。繁荣了我国的花市，现已作过植物组织培养的观赏性植物主要有:甜叶菊、袖珍月季、大丽花、满天星、中国水仙、倒挂金钟叶、香子兰、百合、金桔、君子兰、白兰花、雪松、海棠、郁金香、吊兰、腊梅、巴西铁树、大绣球、虎叶海棠、大花茉莉等。1.4.3.1.2经济植物经济作物中有些植物用种子繁殖，它们的后代便会出现各种变异， 不能保持原来品种的特性，因此，有时需要采用无性繁殖
13、。经济作物中包括蔬菜、果树、油料作物、林木和许多可食用的作物都已进行了组织培养。有的已应用于生产实践之中，使用组织培养这一技术来进行无性繁殖，克服了常规繁殖的许多弊端，避免了病毒感染， 挽救了稀有和面临灭绝危机的物种，并大大加快了繁殖的速度。 这方面的工作， 国内学者已经做了很多研究。在繁殖蔬菜作物的研究工作中，主要针对茄科曾伞形科瞥十字花科9 葫芦科甲豆科曾菊科。、百合科， 、石蒜科，勒科作了广泛的研究工作。 例如策荷科的生姜病害虽有些是土壤感染的，使用无性繁殖的母株经组织培养除去病原菌，亦可减少损伤。近年来，国内学者主要作过的经济作物有 :油菜，甘蔗、苹果、擦树、甘薯、大蒜、水稻、石榴、小
14、麦、澳州茄、扁豆、玉米、桃、黄花菜、黄瓜、山植、草荀、揪树、红麻、称猴桃、葛芭、花生、洪叫司、白杨、佛手瓜、无籽西瓜、香艳梨、白花菜、大白菜、菠萝等。1.4.3.1.3药用植物药用植物由于野生资源少， 栽培技术等问题， 有的尚待开发， 有的供不应求。估计目前短缺的药用植物至少不下100 种。 应用植物组织培养生产药用植物可不受客观外在条件的限制， 便于进行代谢调控和工厂化生产。同时组织培养中的细胞生长速度要比植物正常生长的速度快，接近于分生组织的生长速度等有利条件。例如金线莲 (Anoectochilusformosanus)是一种小型兰花，有名的药用植物，个植株都可人药，可用来治疗肺病、糖尿
15、病、高血压等许多疾病。新鲜植物可以卖到每公斤 150 美元。它通常生长于海拨6001800m 的森林覆盖地，但野生的逐渐消失，因此可以利用组织培养进行繁殖。通常采用的方式有二:(1)种子萌发 :成熟及未成熟种子在人工培养基上萌发，不同植物通过人工授粉得到植物种子，一个周期约需 50一 60d(2)茎培养 :将带有至少一个茎尖的茎段进行体外培养可以得到新的植物， 培养于 25一 27C，照光 16h，4 周继代一次， 可扩增一倍 (Lin 等，1987)近年来，文献报道的已通过组织培养繁殖的药用植物有;红花、平贝母、党参、半夏、， ”东桔梗、构祀、唐昌蒲、玄参、红豆草、小苍兰、紫云英、落蓝、银杏
16、、防风远志、樱” 、香石竹、夹竹桃、甘草、芦荟、黄莲花、娱蛤草、龙胆、黄岑、金鱼草、月觅草、鱼腥草、桅子、满江红、苦丁茶、高山红景天、苦参、人参、画尾草、软紫草、小蔓长春花、粉叶小粟、红豆杉、玉帘、草珊瑚、蔷草、当归、白芷、三七、黄莲、皂荚、胶股蓝等。1.4.3.2花药培养和单倍体植株单倍体植株由具单倍 (单套)染色体的花粉或卵细胞诱导产生的植株。很早以来，生物学家和育种学家们就希望从花粉或卵这些具单倍染色体数目的细胞培养出单倍体植株而为植物育种工作服务。自1964 年古哈 (Guha.s)和马赫施瓦里(5.C.Maheshiwari)在毛叶曼陀罗的花药培养中成功地由花粉诱导形成了单倍体植株以来，花药培养这一领域已经取得了很大的进展，特别是游离花粉培养技术的改进。单倍体植株和纯合植株在单倍体育种的利用，花药培养已用于加速从杂种群体中筛选优良子代，来自Fl 代或较早世代的杂种植物，经过花药培养形成愈伤组织，染色体加倍。 通过培养选育的纯系带有亲本性状，将单倍体用于常规育种可以缩短 5 一 6 代。目前在杂交育种中种质资源比较少，将带有重要价值的野生型基因转移到栽培品种中
