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1、肿瘤细胞增殖动力学细胞生物学系 刘清华 1 What Kind of Disease Is Cancer?2Some Cases病例1：男性76岁， 2003年9月3日因干咳、 少痰、消瘦就诊。CT检查确诊肺癌 3病例3：女性43岁，因上腹部时有疼痛伴返酸 2年、加重1个月入院。胃镜活检报告：胃幽门部黏膜内低分 化癌。4病例8：患者男性，34岁。因发现右锁骨肿块3月入 院。检查右锁骨外段稍隆起，局部膨大，表面皮肤无红肿或静脉怒张，无疼痛；肩关节活动稍受限。X光示右锁骨外段明显骨质破坏及增生。病理报告为右锁骨恶性淋巴细胞瘤。 5病例11：女性68岁，阴道不规则流血4-5个月。妇科检查：子宫前位，
2、如妊娠2月大小，可触及 数个结节，质地中等。超声检查提示子宫混合性占位性病变。CT诊断：宫体癌，右侧卵巢囊肿。病理诊断：子宫恶性混合性苗勒氏瘤，累及输 尿管。6肿瘤学癌发生癌演进临床表现癌治疗癌诊断7CELLCell junctionProliferationExtracellular matrixTelomereSignaltransductionDifferentiationApoptosis82. What We Have Knownabout the Cell Cycle Control?9Oncogene Antioncogene Checkpoints Cell Division
3、Cycle Gene, cdc genes;Cyclins Cyclin Dependent Kinases, CDKs Cyclin Dependent Kinases Inhibitors, CDKIs S phase Promoting Factor, SPF Maturation Promoting Factor, MPF蛋白质水平基因水平103. How to Control in aNormal Cell?11Control of G1 phase Control of S phase Control of G2phase Control of M phase12Control o
4、f G1 phaseProliferation factors Checkpoint （G0G1 entrance、R Point G1S） Cyclin-CDK（cyclinD-CDK46 、cyclinE-CDK2 ） P105RB CDKI1314Control of S phaseCheckpoint (DNA synthesis on、off )CyclinCDKPCNA15SPF (cyclinA-CDK1)CyclinE-CDK2 作为启动蛋白，识别 autonomously replicating sequence ，ARS ，激活复制起点可能是origin recogniti
5、on complex， ORC 的组成部分CyclinCDK1617PCNA细胞增殖核抗原DNA聚合酶的亚基直接参与DNA复制和修复18Control of M phase CheckpointMPF（cyclinB-CDK1)19CheckpointG2M： DNA复制没有完成，激活 wee1 -mik1蛋白激酶，细胞阻滞于G2 期。M中晚期：检查微管蛋白的量、微 管组织中心功能、纺锤体极性、微管 与动粒附着、或附着在动粒上产生的 张力。20MPF的活性调节214. Whats Wrong in a Tumor Cell ?22oncogene的过表达antioncogene 的失活cycl
6、in基因和表达蛋白的异常cdki基因和表达蛋白的异常235. How to Evaluate CellProliferation?24Cell Proliferation Kinetics研究生物体内各种细胞群体在 新生、增殖、消亡过程中处于各种 状态的细胞数量、时间参数和分布 位置的技术手段。25检测方法1. 细胞计数 2. 生长曲线 3. 倍增时间 4. 生长分数265. 丢失系数 6. 标记指数 7. 分裂指数 8. 细胞周期参数271. Cell Counting直接计数台盼蓝计数法比色半定量四唑盐法 28四唑盐法3-4,4-二甲基噻唑2，5二苯基四氮 唑溴盐，简称MTT ;线粒体的琥
7、珀酸脱氢酶将MTT还原为难 溶性的蓝紫色结晶物;比色测定间接反映活细胞数量。 29细胞培养 显色 : 加入MTT溶液(5mg/ml) ，继续培养4h，加DMSO，振荡10min比色：490nm波长测定光吸收值30Breast Cancer Research and Treatmeat 2004;84:251-260 6. Their Research Strategy ?7. The Technology They Used?312. Growth CurveCell culture ;Cell counting：每次至少3瓶，每 瓶至少3次，取平均数；共做7天；作图：培养时间为横坐标，细胞数
8、 为纵坐标，在对数坐标纸上作图。 320.10246810Time/dayCancer CellNormal Cell0.11101001000单层培养Cell Number0.1330246810Time/day0.11101001000Cell Number悬浮培养Normal CellCancer Cell34353. Doubling TimeIn vivo : DT=0.1 t / log Dt log DoDo :首次测得的肿瘤直径（cm ）Dt :t 时间后测得的直径（cm）36Computed Tomography37某转移癌：Do 2，Dt4，t90DT = 0.1 90 /
9、 0.6 - 0.3 = 30(d)effective doubling time, TD eff：考虑细胞丢失因素的细胞倍增时间potential doubling time, TD pot：不考虑细胞丢失因素的细胞倍增时间38原发性肺癌腺癌 64 21鳞癌 85 12间变性癌 55 11 乳腺癌 17 14 结直肠癌 19 90 淋巴瘤 27 4 肿瘤类型病例数倍增时间（周）780例人体肿瘤体积倍增时间 Steel（1977）（未完）394. Growth Fraction，GF肿瘤中增殖细胞占细胞总数的比例GF=P / P+QP : proliferationQ：quiescent405
10、. 丢失系数丢失系数KL / KBKL：细胞群体在增殖过程中的丢失 率KB：细胞群体在增殖过程中的生成 率416. Labeling Index, LILINs / N Ns: Number s phase42常用方法： 3H-TdRBrdU PCNA 、Ki67433H-TdR3H-TdR和细胞短暂孵育；间隔时间取材； 放射自显影； 图像分析仪计数或液闪计数； SPSS 统计分析。4445BrdU BrdU和细胞共孵育较长时间； 取材固定； 加入BrdU抗体； 加入生物素标记的二抗；46加入链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶； DAB显色； 图像分析仪计数； SPSS 统计分析。47Chinese
11、journal of Cancer 2003;22(11):1127-113448PCNA取材固定； 加入PCNA抗体； 加入生物素标记的二抗； 加入底物； 显色； 图像分析仪计数； SPSS 统计分析。49Synovial sarcoma Immunohistochemical Strong staining of PCNA J. Vet. Sci2004;5(2):173-180 50Ki-67Positive staining for Ki67, Cancer Cytopathl 2004;102:142-9517. Mitotic Index，MI经典方法免疫荧光方法52经典方法Syn
12、ovial sarcome. Mitotic figures J. Vet. Sci2004;5(2):173 -180 J Nippon Med Sch 2003; 70（3）219-22653免疫荧光方法548.Parameter of Cell CycleTc 、TG1、Ts、TG2和TM；常用的有3H-TdR标记法和流式细胞技术 flow cytometry 55Flow Cytometry利用流式细胞仪flow cytometre， FCM细胞快速、准确、多参数的定量分析体积，DNA含量、蛋白质含量、酶活 性、细胞膜受体量、表面抗原量等等5657 无菌分类收集活细胞。58Breast
13、 Cancer Research and Treatment 2004;84:251-2605960应用肿瘤的周期化、同步化治疗LI检测对化疗药物的敏感性提示疗效和预后癌前病变的检测 完61作用特点药药物名称非细胞周期特异性 氮芥、其他氮芥类(氮化芥)、芥 丁酸等细胞周期特异性 （G1期药物）环磷酰胺、噻替派、溶肉瘤素、 双氯乙亚硝基脲、放线菌素D、 红比霉素、光辉霉素、链氮霉素 。氟尿嘧啶时相特异性 （S期药物）3H胸腺嘧啶核苷、阿糖胞苷、 脱氧核苷、氨甲蝶呤、羟基脲、 重氮丝氨酸、喜树碱时相特异性 （M期药物）秋水仙素、长春花碱、长春新碱62636465666768癌分子细胞生物学癌相关基因癌遗传学环境致癌69
