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1、II -免疫分析法Immunoassays抗体 -生物体自造的“magic bullet”医医 疗疗直接或与直接或与毒素毒素连结连结攻攻击击病病变变細胞細胞 研研 究究各种免疫分析各种免疫分析抗体药物销售趋势图抗体药物销售趋势图国际抗体药物 2009年美国市场上的抗体药物成为生物 技术药物销售额最大的类别。 2010年美国市场的单抗药物销售额为185 亿美元 2011年，全球单抗药物的市场总量已经 达到628亿美元， 世界范围内的单抗药物销份额约是整个 生物制药市场份额的36%。国内抗体药物 目前我国的上市抗体品种中,国外进口单 抗占据多数 2011年国内市场规模超过10亿元 我国抗体药物产业
2、化的主要限制因素： 动物细胞大规模培养技术已成为各个国家生 物医药产业化的核心竞争点 抗体下游纯化成本已占45%到70%高质量纯 化工艺研究刻不容缓 QbD（质量源于设计）理念的应用Antibody and structure特点：2个基因决定一个蛋白质与抗原的结合力强，高度专一性抗原和抗原决定簇 一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇 每個 抗原决定簇至少誘生一种专一性抗 体 蛋白质抗原的决定簇含有六个以上氨基 酸。 克隆选择 学说单抗和多抗 多克隆抗体（polyclonal antibody）指由 不同B细胞产生的针对多种抗原决定簇的 多种抗体混合物，如免疫血清。 单克隆抗体（ monoclo
3、nal antibody）指由 一种 B 细胞生产，针对某一抗原决定簇 的单一抗体。Preparation of polyclonal antibodies传统抗血清抗 原免 疫混合抗体1 23412341 234免疫前要先把抗原作成乳剂约在两月內 注射五到八次Preparation of monoclonal antibodiesPreparation of recombinant antibodies淋巴细胞淋巴细胞总总RNARNA抗体轻、重链文库抗体轻、重链文库重组单链抗体基因重组单链抗体基因轻、重单链基因轻、重单链基因大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系单链抗单链抗体体单链抗体 在重链与轻
4、链之间加上一段连接肽，连 成一条单链 如果仅是两条链的可变区，称为ScFv 连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不 宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链 少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是 GGGGS3Ab as antigen- Primary and secondary antibodyPrimary AbSecondary AbPrimary AbProtein A 二抗针对一抗的物种特异性Protein A针对所有动物抗体FcImmunoassays The most important biological assays for:The most important biologic
5、al assays for: Identification of proteins and small bio-Identification of proteins and small bio- moleculesmolecules Quantification for complex biological sample Quantification for complex biological sample without separationwithout separation Powerful separationPowerful separation High sensitivity,
6、 specificity and accuracyHigh sensitivity, specificity and accuracy 抗体的标记方法 放射性同位素标记 酶标记 荧光标记 有机分子荧光标记 绿色荧光蛋白标记 稀土荧光标记 通用标记放射性碘标记HRP酶标记简单化学偶联方法：1过碘酸钠法：仅用于HRP的标记。HRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性无关的 多糖羟基氧化为醛基，再与抗体蛋白的游离氨基结合，结合反应后，再加人 硼氢化钠(NaHB4)还原后，形成稳定的HRPCH2NHIgG酶标记物。为防 止酶蛋白氨基与醛基反应发生自身偶联，常在标记前知用二硝基氟苯(DNFB) 封闭酶蛋白
7、上的和氨基。 2戊二醛交联标记法：戊二醛具有两个活性醛基，分别与酶分子和抗体分子上的氨基结合。 NaHB4HRPLabeling with isoFITCGFP labelingGFP geneScFv geneVectorexpressionGFP geneProtein A geneVectorexpressionAb-Fc通用标记+Avidin/streptA+Anti-digoxin Ab 2nd AbProtein APrimary AbPrimary AbImportant assays Immunostaining Western blot Fluorescent microsc
8、opy Quantification of immunostaining Quantitative assays: Radioimmunoassay, RIAcompetent binding Fluorescence immunoassay, FIA FPIA-homogeneous assay TRFIA Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISAImmunostainingFluorescence/luminescenceColorizationor组织切片或培养细胞单层细胞/组织固定免疫染色（荧光）显微镜观察免疫荧光标记的c-Myc phalloi
9、din荧光标记的微丝 荧光染色的细胞核 合成图像 Immunoblot - Western BlotElectroblottinggelPVDF membraneImmunostaining封闭分析 抗体显色抗体显色数字化灰度 图像分析0.5 1 2 4 6 8 12 16 24 30 (h)c-mycp53Cyclin D1ActinCaNCaM:La3+HRPStreptAvidin BiotinRIA Assay免疫竞争结合分析-小分子抗原 分析的基本方法Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag* AgAb + * Ag*AgAb: Precipitant放射性计数常用分离沉淀技
10、术 盐析法：饱和硫酸铵、硫酸钠 聚乙二醇法（w=6000） 特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大 抗体免疫沉淀法 特点： 分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高 ，但成本高 固相吸附剂RIA测量步骤 恒量的* Ag、Ab加入反应管中 加入待测样品、或标准品（已知浓度） 37或4 温育 加入分离剂分离结合及游离部分 测定以总放射性为分母，测定* AgAb 为分 子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度 为坐标，制作标准曲线 待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度Calibration curveELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay）Sandwich
11、 ELISA竞争法（略）High ConvenienceHigh Sensitivity96-well plate包被封闭结合显色酶标仪测定hv洗涤洗涤洗涤终止酶的底物邻苯二胺(OPD) + H2O2TMBABTSHRP的底物氧化产物(橙红色)492nm吸收2mol/L硫酸终止反应AP的底物硝基苯磷酸酯 对硝基酚(黄色)NaOH终止反应405nm吸收峰磷酸4-甲基伞酮 （荧光底物）荧光偏振免疫分析Principle of fluorescence polarization emitting dipoleabsorbing dipoleexcitation light polarized alo
12、ng zxzyIIdetectorFluorescence polarization immunoassayAg + Ab AgAb + Ag + * Ag* AgAb + * Ag High polarized fluorescenceLow polarized fluorescence偏振度r时间分辨荧光免疫分析荧光物质荧光寿命 (ns)荧光物质荧光寿命 (ns) 非特异荧光背 景110Sm3+ -NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000 球蛋白3.0Eu3+-NTA714000 细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000 FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰
13、氯14Dy3+-PTA1000 罗丹明B3.0荧光背景和常用探针分子的荧光 寿命Lanthanide labelingLanthanide labelingLigand labelingCTTABCPDA镧系荧光底物法DELFIA法荧光试剂标记可以消除环境中稀土污染造成的荧光背景固相时间分辨荧光分子印迹和核酸适配体思考题什么是抗体？其结构特征是什么？怎么由基因编码一个抗体？ 什么是抗原决定簇？一个抗原分子是否只有一个抗原决定簇？ 抗体与抗原结合的特异性如何？为何有如此高的特异性？ 抗体有哪些应用？ 什么是抗体的Fab片段和Fc片段？其结构分别是如何？ 什么是单抗和多抗？分别是如何制备的？哪一种
14、抗体的特异性高？为什么 ？ 什么是抗体库？ 什么是单链抗体？什么是ScFv？如何制备单链抗体？单链抗体有何应用？ 什么是二抗？二抗与一抗如何结合的？如何选择使用二抗？ 什么是Protein A？它如何与抗体结合的？ 什么是免疫分析？免疫分析有哪些特点？有哪些主要类型的免疫分析？ 抗体标记有哪些种类和方法？ 有哪几种通用抗体标记方法？分别如何使用？ 如何进行免疫染色观察？Western Blot的原理和要点是什么？ 什么是RIA，其分析方法的原理和要点是什么？ 什么是Sandwich ELISA？其分析原理和要点是什么？ 什么是荧光偏振免疫分析？其特点和原理是什么？ 什么是时间分辨荧光免疫分析？用什么标记物？有哪些类型？其特点和原 理分别是什么？ 什么是分子印迹分析法？ 核酸适配体是什么？如何应用？
