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1、淋巴细胞的分离 和功能检测Separation and Assays for Lymphocytes第一节 外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclercell，PBMC):单核细胞淋巴细胞人不同细胞的漂浮密度红细胞：1.091.1嗜酸性：1.091.095嗜中性：1.0801.085B细胞：1.0621.075T细胞：1.0651.077NK： 1.0501.070单核细胞：1.0501.066血小板：1.0301.060Ficoll分层液分离法属于单次密度梯度离心分离法 分离液组成：聚蔗糖（商品名为Ficoll）泛影葡胺（常用商品为isop
2、aque、hypaque）故又称Ficoll-hypaque分层液 Ficoll：分子量：40KD高密度 低渗透压 无毒性使用浓度：60g/L (密度：1.020） 泛影葡胺：使用浓度：340g/L（密度：1.200）Ficoll-hypaque的密度：分离人外周淋巴细胞：1.0770.001分离小鼠淋巴细胞 ：1.088分离马淋巴细胞 ：1.090 操作过程：将抗凝全血以Hanks液适当稀释后轻轻叠 加在分层液上.试验尽量在低温下进行（4 8 或冰浴）。水平式离心（2000rpm，20min）吸出白色云雾状单个核细胞层，洗涤3次备 用密度梯度分离单个核细胞（ Ficoll分层液）细胞活性：
3、95%单个核细胞纯度：95%细胞获得率： 80%最佳温度： 20Percoll分离法属于连续密度梯度离心分离法Percoll：包有乙烯吡咯顽酮的硅胶粒特点：渗透压低、黏度小、无毒扩散常数低，可形成稳定的梯度操作： Percoll原液（密度1.135）加等量磷酸缓冲 液 高速离心，使分层液形成连续密度梯度 将细胞悬液叠加在分层液上，低速离心后得 到四个细胞层 吸取所需细胞层，洗涤备用密度梯度分离单个核细胞（ Percoll分层液）细胞活性：95%细胞纯度： 98%细胞获得率： 75%最佳温度： 20密度梯度离心法注意事项：无菌操作安全防护注意最佳温度操作适当稀释血液样品（稀释倍数至少1倍 ，但要
4、收集血浆成分则不能稀释）第二节：外周血淋巴细胞的分离和纯化外周血单个核细胞中还含有少量单核 细胞，甚至还有少量红细胞和血小板，若 特定试验要求应该除去这些成分.红细胞去除法低渗裂解法PBMC中加入无菌双蒸水，调节浓度至 2X106，轻轻混匀45s，即刻加入等体积 1.8%氯化钠，使溶液恢复等渗。氯化铵处理法PBMC中加入一定量的0.83%的氯化铵溶 液，轻轻震荡2分钟，即可溶解红细胞血小板去除法离心洗涤法HBSS或PBS洗涤分离的PBMC 2-3次 ，可去除大部分血小板。单核细胞去除法粘附法单核细胞37下能粘附在塑料或玻璃表面 ，淋巴细胞则不能，将PBMC置于细胞培 养瓶中培养1小时，即可去除
5、单核细胞。淋巴细胞纯度：95%活性：95%L-亮氨酸甲酯法L-亮氨酸甲酯在溶酶体酶的作用下可转化 成有毒L-亮氨酸- L-亮氨酸甲酯，导致单核细胞 破坏。同时可去除NK细胞和Tc细胞。淋巴细胞纯度：99%活性：95%羰基铁吞噬法单核细胞可吞噬羰基铁粉，吞噬后的 细胞比重增大，分层液密度梯度离心时沉 淀于管底。免疫磁珠法利用抗体致敏的磁珠与细胞结合，让细胞 通过磁细胞分选仪，分离具有特异标记的 免疫细胞。第三节 外周血淋巴细胞及其亚群的选择性分 离及纯化T细胞及其亚群的选择性分离尼龙棉柱分离法利用B细胞和单核细胞易于粘附于尼 龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分离操作：将尼龙毛（聚酰胺纤维）填充于
6、5- 6mm内径的塑料管中，单个核细胞悬液 加入，371-2小时，10%-20%FCS灌洗 ，收集洗脱液。回收率：20%30%T细胞纯度：90%一般不用于分离B细胞花环形成法-E花环成熟T细胞表面有绵羊红细胞受体，即 E受体（CD2),可与绵羊红细胞结合形成花 环，经Ficoll密度梯度离心，再经裂解即 可获得T细胞。T细胞回收率差异大T细胞纯度：95%分离过程可能激活某些T细胞免疫磁珠分离法将抗体与磁性微珠结合形成免疫磁珠 （immmunomagnetic beads，IMB),免 疫磁珠与细胞结合后，在外加磁场的作用 下，免疫磁珠-细胞复合物被吸附，从而 起到分离的作用。单克隆抗体-磁珠分
7、离系统 （monoclonal antibody-magnetic cell sorting，MACS)阳性分离：获得被吸附的细胞阴性分离：获取非吸附细胞分离纯度：80%99%得率：60%90%，仅次于流式细胞仪CD4+ T细胞流式细胞仪分选法流式细胞术（flow cytometry，FCM)是 一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测 量的分析和分选技术流式细胞仪流动室和液流系统 激光源和光学系统 光电管和检测系统 计算机和分析系统 细胞纯度：99%细胞得率：90%细胞活性：95%B细胞及其亚群的选择性分离尼龙棉柱法操作见T细胞分离部分该法曾经是经典的B细胞分离方法， 但收获率较低，现已很少使用
8、EA花环 B细胞表面带有IgG Fc段受体，AgAb 复合物中IgG Fc段牢固结合；这类红细 胞抗体致敏的动物红细胞（EA)黏附在B 细胞周围形成花环。免疫磁珠法流式细胞分选法细胞的保存及活力测定 保存10%20%的灭活小牛血清等渗培养液重 悬。短期置4，长期：二甲亚砜+ -196 活力测定台盼兰染色死细胞呈蓝色，活细胞不着 色。 第四节 淋巴细胞表面标记的检测 Assays for Lymphocyte Surface Markers淋巴细胞的表面标志CD抗原 特 异 性 CD2 E受体、全部T细胞和部分NK细 胞CD3 成熟T细胞CD4 Th细胞、M、HIV受体CD8 Tc细胞、NK细胞
9、的亚型CD25 IL-2受体、活化T细胞CD16、CD56 NK细胞免疫荧光技术直接法间接法微量细胞毒实验针对表面标记的单抗与免疫细胞结合 后，在补体的作用下会杀伤该细胞，细胞 膜失去屏障作用，加入伊红染料后会将细 胞染成红色，阴性细胞不着色。免疫酶染技术抗体用特异性的酶标记后不影响其与 抗原结合，将酶标记抗体与免疫细胞作用 ，在酶底物存在时，阳性细胞将产生颜色 反应，在光学显微镜下即可对免疫细胞进 行定量和定性ABC法（Avidin-biotin-HRP complex ）APAAP(Alkaline phosphatase-anti- alkaline phosphatase techni
10、que) 碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色 法(APAAP法)，用兔抗鼠IgG起搭桥作用 ，其中一个Fab段连接McAb ，另一个Fab 段连接APAAP复合物，再通过复合物中 的碱性磷酸酶催化底物显色来判断抗原分 子的存在。 APAAP酶免疫桥联法第五节 T、B淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测（一）T细胞增殖试验T细胞在体外受有丝分裂原或抗原刺激后，细胞代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应。如细胞变大、胞质增多、出现空泡、核质疏松、核仁明显并转化为淋巴母细胞，又称淋巴细胞转化试验（lymphocyte transformation test ,LTT
11、)丝裂原诱导的增殖反应技术方法 1. 用RPMI10将PBMC配成1x106/ml的悬液。 2. 用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀释液 。 3. 96孔板中选择一行（共12孔），每孔中加入 100l细胞。指定每相邻3孔为一组。前3组分别 加入一种稀释度的PHA溶液，最后一组加培养 液（对照组）。 4. 37C ，5CO2，54h。5. 配制浓度为50ci/ml的3HTdR。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定丝裂原诱导的增殖反应6. 每孔加入50ci 3HTdR，继续培养18h。 7. 用多孔自动收集仪分别收集每孔细胞于一小管 中。溶解细胞，将DNA过滤到滤纸上，洗
12、去未 掺入的3HTdR，最后用100的甲醇洗涤，以利 滤纸干燥。 8. 将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。 9. 扣除本底，计算每一组3个复本的平均数。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定丝裂原诱导的增殖反应影响因素 1. 细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应 检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有些血清可能激活或抑 制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可 采用灭活的AB血清。 3. 细胞培养板类型：根据细胞数量采用不同形状 底部的培养板。 4. 微生物污染：可降低细胞增殖能力。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定单向混合淋巴细胞培养反应原理T细胞受体能够识别同种异型MH
13、C分子。当把2个不同 个体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起 增殖。增殖的强度与两者之间MHC的差别的程度成正比 。所以同种异型混合淋巴细胞反应的强度反映2个个体 之间MHC差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果 是2个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是 双向混合淋巴细胞培养试验。将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射， 使其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞 ，则此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能 力。在实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供 者MHC的反应能力，所以适合采用单向混合淋巴细胞培 养反应。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定单
14、向混合淋巴细胞培养试验方法1. 分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1 x 106/ml。2. 刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度25g，37 C， 5C，30min）或放射性核素照射（2000 rad）的方法处理刺激细胞。3. 96孔板中，每孔加入1x105的刺激细胞和 1x105反应细胞。 37C，5CO2，46d。加 3HTdR，继续培养18h。阳性对照孔加反应细胞 和丝裂原，不加刺激细胞。阴性对照孔只加照 射的自身细胞。3复本。4. 收集细胞，液闪仪计数，打印结果。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定单向混合淋巴细胞培养5. 计算相对反应（RR）（实验组cpm阴性对照组cpm）RR
15、阳性对照组cpm阴性对照组cpm T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定单向混合淋巴细胞培养注意点1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查 细胞活力。2. 培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激 或抑制反应。3. 本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于 20000 rpm。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定成熟淋巴细胞转化淋巴细胞抗原诱导的特异性增殖反应原理本试验测定T细胞在体外对某一特定抗原的 特异性免疫应答能力。所用抗原可以是初次接 触的抗原，也可以是曾经免疫过的抗原。常用 的测定回忆反应的抗原有纯化蛋白衍生物（ PPD）和破伤风类毒素（TT）。这2种抗原都被 常规列入计划免疫接种范畴，成人应该对它们 有回忆反应。在某些免疫缺陷病中，对它们的 特异性回忆反应可减弱或消失。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定抗原性刺激物：破伤风类毒素链球菌激酶纯化蛋白衍生物白色链球菌同种异型抗原（HLA)抗原诱导的特异性增殖反应方法（以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应 为例） 1. 分离PBMC和APC，APC用丝裂霉素或放射性 核素处理。 2. 96孔板中每孔加入1x105 PB
