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1、第十七章 基因重组与基因工程(genetic recombinationand genetic engineer)1基因重组(genetic recombination)是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。基因克隆(gene cloning)将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程(genetic engineering)是将不同来源的DNA片段与载体分子连接形成重组DNA分子，再导入宿主细胞内进行表达，也称重组DNA技术。2本章主要内容重要
2、的工具酶基因克隆常用的载体重组DNA基本原理重组技术在医学和制药工业中的应用3第一节 重要的工具酶工具酶基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类。4一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。根据限制酶作用特性，一般分为、和型，其中常用的是型限制酶。5限制酶（型）识别及切割位点特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种末端结构： 5粘性末端3粘性末端平端或钝端回文序列(palindrome)
3、是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复;粘性末端(sticky end)是指经内切酶特异切割后产生的5末端突出和3末端突出的碱基序列相互间具有互补性。6 产生5-粘性末端 产生3-粘性末端7 产生平(头末)端/钝端其它特殊性质的型限制酶同裂酶（异源同工酶）同尾酶可变酶8同裂酶 又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3或5粘性末端，称为同识异切。 9同裂酶同识同切10同裂酶同识异切11同 尾 酶同尾酶指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。12可变酶
4、可变酶识别顺序中的一个或几个碱基是可变的， 并且识别顺序往往超过6个碱基对。如， Bstp，其识别顺序为GGTNACC。13常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称酶名称识别顺识别顺 序同裂酶同尾酶Bacillus amyloliquefaciens H 解淀粉芽孢孢杆菌BamHGGATCCBstBgl MboBacillius globigil 球芽孢孢杆菌Bgl ACATCTEscherichia coli RY13 大肠肠杆菌EcoRGAATTCHaemophilus influenzae 流感嗜血菌Hind AAGCTTHsuProvidencia stuartii 164 普罗罗威登细细
5、菌PstCTGCAGSalpStreptomyces albus Subspecies pathocidicus 白色链链球菌SalGTCGACAva Xho14限制性内切酶的应用通过切割不同来源DNA双链的特异碱基序列，产生含有黏性末端或平端的、长度不同的DNA片段。用于DNA重组、制备探针、分子杂交、DNA序列分析等。15二、DNA聚合酶（最常用的DNA聚合酶有以下4种）DNA聚合酶（全酶） DNA聚合酶大片段Klenow片段Taq DNA聚合酶T4 噬菌体DNA聚合酶16 DNA聚合酶 E.Coli DNA聚合酶（DNA pol ） 是一个具有3 种酶活性的多功能性酶。包括：53DNA
6、聚合酶活性 53核酸外切酶活性35核酸外切酶活性17DNA pol 应用 常用来催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针； cDNA第二条链的合成； 对DNA3突出末端进行标记； DNA序列分析。18E. coli DNA pol. 催化缺口平移*T*T*T*TMg2+D N a s e I53353 5533553355335dATP,dCTP,dGTP -32P dTTPE. coli DNA POL I19 Klenow片段（DNA pol.大片断）20Klenow片段用途 补齐双链DNA的 3末端； 用标记碱基补齐3末端 ； 用于cDNA克隆中 第二股链的合成； DNA序列分析。
7、21 Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）作用特点1） Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围70 75，2） 95以上高温，半小时不失活， 3） 最适合用于聚合酶链反应（PCR）。 22三、逆转录酶(reverse transcriptase)特点逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶 活性： 以单链RNA为模板， 催化合成cDNA单链 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。23逆转录酶的应用： 将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库； 补平和标记5-末端突出的DNA片段； 代替Klenow酶用于D
8、NA序列分析； 制备杂交探针等。24四、DNA连接酶(DNA ligase) 催化双链DNA中一条链的3OH与另一条链的5PO3H2形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNA长链 。DNA连接酶的用途（1） 两个双链DNA片段连接起来5- ACG AATTCGT-3 T4DNA连接酶 5-ACGAATTCGT-33- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5（2） 修补带有缺口的双链DNA分子T4DNA连接酶25五、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能够催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基团。用途 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5端磷酸基后，可防
9、止载体自身环化连接，提高重组效率。 用32P标记5-端前，去除5-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5-端进行标记。26六、末端 （脱氧核苷酸）转移酶(TdT) 作用将标记或未标记的dNTP加到DNA的3OH末端；也可催 化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进 一步连接。应用 探针标记 P32-.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接3327重要的工具酶工具酶 活性 限制性核酸内切酶 识别特异碱基序列，切割DNA T4 DNA连接酶 催化DNA5-磷酸与3-羟基形成磷酸二酯键 DNA聚合酶 以DNA为模板
10、合成DNA 逆转录酶 以RNA为模板合成cDNA 碱性磷酸酶 切除5末端磷酸T4多聚核苷酸激酶 催化核酸5-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶 催化3-端合成同聚尾28第二节 基因克隆常用的载体载体(vector)是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运送到宿主细胞的运载工具。 其化学本质为DNA分子 。本节主要内容载体必须具备的基本条件 载体的分类常用的载体29一、载体必须具备的基本条件 具有独立复制能力 具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点) 具有遗传表型或筛选标记 有足够的容量以容纳外源DNA片段 可导入受体细胞。30二、载体的分类*（一） 克隆载体用来克隆和扩增DNA片段的载体。
11、有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA三类。 （二） 表达型载体为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体称为表达型载体。表达型载体除需载体必备条件外，还需相应的启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控构件。31三、常用的载体 （一） 质粒 (plasmid)：是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。作为克隆载体的质粒应具备以下特点：1. 分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数；2. 具有1个以上的遗传标志，便于筛选；3. 具有多克隆位点。32总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。
12、广泛应用的质粒：pBR32质粒、pUC系列等33pBR322质粒 4363 bp 含一个复制点含一个抗氨卞青霉素基因(ampR) 一个抗四环素基因 (tetR) ampR和tetR抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入当外源基因插入抗药基因内后，抗药基因失活。 AmpRAmp敏感(AmpS )、TetRTet敏感(TetS).34pUC系列质粒由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；（1） 2674bp；（2） 有ampR和与M13噬菌体相同的多克隆位点（MCS）（3）有1个来自E.coli的LacZ基因片断, 编码半乳糖苷酶，便于蓝白筛选35(二)噬菌体组成特点：双链
13、线状DNA分子，全长50kb，含66个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。36噬菌体两种生长途径（示意图）37噬菌体感染细菌后的两种生长途径溶菌性生长 噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长 噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解 。38第三节 重组DNA基本原理（DNA重组基本程序包括下列过程）分获取目的基因和载体接目的基因与载体的连接转重组DNA导入宿
14、主细胞筛重组DNA的筛选与鉴定39一、目的基因的获取（分）目的基因是指所要研究或应用的基因，也是需要克 隆或表达的基因。目的基因来源1） 制备基因组DNA2） 制备cDNA3） 聚合酶链反应4） 人工合成基因40（一）制备基因组DNA（基因文库， genomic library ）分离、纯化基因组DNA 在EDTA等存在下，用蛋白RE 酶K消化细胞、酚抽提；大小不同酶切片段 常用蔗糖梯度离心或电泳 分离酶切片断；分别与同样RE酶切的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体 DNA连接酶连接；导入宿主细胞、扩增 导入宿主细胞内培养、扩增；得到分子克隆混合体 用分子杂交等方法进行鉴定、（基因文库） 筛选
15、、再扩增，分离、回收。 41（二）制备cDNA （cDNA文库）分离目的基因的mRNA逆转录生成cDNA单链水解去除mRNA，合成cDNA双链水解回折处单链 得到平端双链cDNA与载体连接，导入宿主细胞扩增 构建cDNA文库。42（三）聚合酶链反应( PCR)在体外，以目的基因为模板，在DNA引物、dNTP、TaqDNA Pol等存在下，构成一个反应体系。经94变性、54退火及72延伸3个步骤的反复多次循环（2530次），扩增目的基因（见18章）。（四）人工合成基因应用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。（一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段）43二、 目的基因与载
