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1、高效液相色谱结果处理与分析第二部分(High performance Liquid Chromatography，HPLC)一、色谱数据处理二、色谱图三、色谱图名词术语四、色谱峰检测五、HPLC测定步骤与内容一.色谱数据处理检测器记录仪积分仪色谱工作站色谱仪信号输出图l色谱数据处理是通过ADC转换器,把模拟信号转换成数字信号,然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。l数据处理原理自动处理 人工修正 峰的检测 数据采集 基线校正和重叠峰的分离 l数据处理方法l色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的 曲线图, 其纵坐标为信号强度, 横坐标为时间二.色谱图 (Chromatogram)样品组
2、分分离示意图三.色谱图名词术语(1)l色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响 应信号. l峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线. l峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离. 色谱峰时间(分)峰高峰底响应值 (mV)基线 l切线峰宽(Peak Width, 峰宽):在峰两侧拐点处所作切 线与峰底相交两点之间的距离. l半峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的中点 作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的 距离 .l峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值.三.色谱图名词术语(2)色谱峰的
3、判断 (最小面积)响应值时间峰面积切线半峰宽切线峰宽三.液相色谱图名词术语(3)l保留时间(TR)(Retention time): 组分从进样到出峰最大 值所需的时间. l死时间(t0)(Dead time): 不被固定相滞留组分的出峰时 间.（其测定测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸 收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳，反相色 谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等）.l调整保留时间：tR tRt0l保留体积(VR)(Retention volume): 组分从进样到出 现峰最大值所需的流动相体积.l死体积(V0)(Dead volume): 不被固定相滞留的组分, 从进样到出现峰最大
4、值所需的流动相体积.l调整保留体积：VRVRV0tR FC lFc: 流动相的流速 mL/min.三.液相色谱图名词术语(4)l谱带扩展(Band Broadening): 由于纵向扩散,传质阻 力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象. 三.液相色谱图名词术语(5)三.液相色谱图名词术语(6)l拖尾峰(Tailing Peak): 后沿较前沿平缓的不对称峰. l前伸峰(Leading Peak): 前沿较后沿平缓的不对称峰. l鬼峰(Ghost Peak): 并非由试样所产生的峰,亦称假峰.Excellentt = 1.0 - 1.05Acceptable t = 1.
5、2Unacceptable t = 2Awful t = 4正常前伸三.液相色谱图名词术语(7)l基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号. l基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线 波动.l基线飘移(Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变 化. 基线基线噪音基 线 飘 移峰宽半峰宽标准偏差l标准偏差()(Standard deviation): 0.607倍峰 高处峰宽的一半，为便于测量，改用半峰宽。目的 是为了计算柱效率(柱效)。l柱效（理论塔板数） ： 或三.液相色谱图名词术语(8)进样图示中塔板数为3.l
6、塔板理论 类似蒸馏中的气液平衡l峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个 “阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采 用下面两种方式判别峰讯号的变化：依照信号斜率的变 化检测信号 依照积分面积检测 峰信号四.色谱峰检测切线色谱峰的判断 最小面积五.HPLC 测定步骤与内容1.确定色谱条件: 色谱柱的选择，流动相、流速 、检测波长、柱温及进样量等。2.绘制标准工作曲线3.精密度试验与回收率试验4.实际样品含量测定1.确定色谱条件l 色谱柱的选择l 流动相l 流速l 检测波长l 柱温l 进样量2.绘制标准工作曲线l标准曲线是定量分析的根本依据.l药物浓度（或质量）与药物在检测器上的产
7、生的信号 （通常采用峰面积A）成比例(正比).l标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度.l标准曲线线性一般采用5-9点，并非点越多越好!l准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近 的程度，用百分回收率表示。l相对回收率 直接反映测定结果与真实值的接近程度,应 控制在100%左右(95%105%)。l绝对回收率 模拟生物样品经整个样品处理过程,而相 应标准溶液直接分析,两者的响应值之比称为绝对回收 率。绝对回收率一般应大于70%,过低说明方法中待测物 质损失严重。l测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试 验法”和“加样回收试验法”。3.准确度(accuracy)
8、(1)回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定 ，测定值为 M回收率100%=AM R空白X(2)加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已 知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M100%X=APMR数据要求 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价， 如高、中、低三个不同浓度样品各测三次.回收率4.精密度(precision) l精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取 样测定所得结果之间的接近程度,表示测定的重现性。用 偏差（d）、标准偏差(SD )、相对标准偏差(RSD )(变异 系数，CV )表示. (1)偏差(d）： 测量值与平均值之差(2)标准(偏)差(SD
9、或S）(3)相对标准(偏)差（RSD），也称变异系数(CV,有日内 变异与日间变异两种)5.检测限(limit of detection,LOD) l指在确定的实验条件下，HPLC能检测出待测物的最低浓 度或含量。(是限度检验效能指标，无需定量测定，只 要指出高于或低于该规定浓度即可).(1)信噪比法 把已知低浓度试样测出的信号与空白样 品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低 浓度或量。一般以信噪比（S/N）31或21时的相应 浓度或量确定检测限。(2)非仪器分析目视法 用已知浓度的被测物，试验出 能被可靠地检测出的最低浓度或量.l指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一 定
10、准确度和精密度要求。6.定量限(1imit of quantitation，LOQ)(1)信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为101 时相应的浓度或注入仪器的量进行确定.(2)按1984年国际纯粹和应用化学联合会(IVPAC)规定： 用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值 ，再经试验确定方法的实际测定下限.7.专属性(specificity,或称选择性）l指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在的情 况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映 该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力， 是用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量.8. 线性（Linea
11、rity）l在设计范围内，测试结果与试样中被测物浓度呈正比关 系的程度。l线形通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率（ Slope）来表示。l数据要求：至少需要五个浓度考察线形，需提供相关系 数、y截距（检定的可能偏差）、回归斜率及方差等参 数，应列出回归方程数和线性图。l指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法 适用的高、低限浓度或量的区间。 l范围的确定可因测定项目不同而有不同要求： 9.范围（Range） 含量测定范围为80%-120%； 含量均匀度范围为70%-130%； 杂质测定应为被测杂质限度的50%-120%； 溶出度应为测定范围的20%。l指测定条件稍有变动时，结果
12、不受影响的承受程度， 为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间 在正常情况下实验结果重现性的尺度。l分析方法重现性的测定是通过在不同的实验室内不同 的实验者对同一样品的分别测试而获得的。(获得的这 种再与正常检定下的精密度进行比较,从而确定该法的 耐用性,或称粗放度).10.耐用性(1)鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求. (2)杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外,其它都 不要求。 (3)杂质的含量测定除检测限外，其它都要求。(4)含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都 要求。11.应用0.20.61.01.41.82.22.63.0Time, min0%50%100%Rel. Int. (%)0.20.61.01.41.82.22.63.0Time, min0%50%100%Rel. Int. (%)
