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1、外科学外科学( (骨外骨外) )专业优秀论文专业优秀论文 阻断阻断 ICOSICOS 共刺激通路抑制异体肢体移共刺激通路抑制异体肢体移植急性排斥反应的实验研究植急性排斥反应的实验研究关键词：关键词：ICOSICOS 基因表达基因表达 RNARNA 干扰干扰 质粒载体质粒载体 淋巴细胞淋巴细胞 共刺激通路共刺激通路 急性排斥反急性排斥反 应应 异体肢体移植异体肢体移植摘要：第一部分质粒介导 shRNA 抑制大鼠淋巴细胞 ICOS 基因表达的实验研究 目的：构建抑制大鼠淋巴细胞 ICOS 基因表达 shRNA 的重组质粒，观察其对大鼠 淋巴细胞 ICOS 基因及蛋白表达的影响。 方法：选择 4 个
2、干扰位点，分别合 成 4 对干扰寡核苷酸，形成双链后构建于 pSilencer 4.1-CMV neo 质粒载体， 经阳离子脂质体介导转染大鼠淋巴细胞。转染后 48 小时，分别用半定量 RT- PCR 检测 ICOS 基因 mRNA 的抑制程度，流式细胞仪检测细胞表面 ICOS 表达水平。 单向混合淋巴细胞反应检测细胞的增殖能力，ELISA 法检测细胞因子 IFN- 和 IL-4 分泌水平。 结果：转染后 48h，实验组淋巴细胞 ICOS 的 mRNA 水平和 ICOS 分子表达明显低于对照组(Plt;0.05)，对照组间无明显差异。转染 干扰质粒的淋巴细胞增殖能力明显降低，细胞因子 IFN-
3、 和 IL-4 的含量也减 低。 结论：表达 shRNA 的干扰质粒可以抑制大鼠淋巴细胞 ICOS 基因的表达， 降低 T 淋巴细胞活化增殖能力，为进一步研究 RNA 干扰 ICOS 基因在移植免疫耐 受方面的应用提供了实验基础。 第二部分 RNA 干扰质粒抑制异体肢体移植急 性捧斥反应的实验研究 目的:研究 RNA 干扰阻断 ICOS 共刺激通路在大鼠异体 肢体移植急性排斥反应中的作用。 方法：采用改良肢体移植法行 Wistar 到 SD 大鼠肢体移植 27 例，分 3 组，每组 9 例。其中 A 组为排斥组，不给予特殊 处置；B 组为对照组，移植术后阴茎背静脉注射梭华 Sofast-pSi
4、lencer 4.1 空 载体复合物；C 组为干扰组，移植术后注射梭华 Sofast-pSilencer 4.1- ICOSshRNA 干扰质粒复合物。术后第 8d 每组处死 SD 鼠 3 只，取组织行病理检 查，RT-PCR 及流式细胞仪检测体内 ICOS 表达水平，混合淋巴细胞反应及细胞 因子的检测。其余大鼠观察生存情况及肢体存活时间。结果：A 组平均存活时 间(11.341.11)d，B 组平均存活时间(11.141.32)d，C 组平均存活时间 (16.121.72)d(Plt;0.05)。A、B 组病理示中、重度急性排斥反应，C 组 急排反应轻微。体内 ICOS 基因表达 C 组明显
5、低于 A 组和 B 组。混合淋巴细胞反 应刺激指数 A 组 5.261.42，B 组 5.370.27，C 组 2.370.35(Plt;0.05)。C 组中细胞因子(IFN- 和 IF-4)的表达较 A、B 组均降低，但 IFN- 降低更显著。 结论:体内转染 pSilencer 4.1- ICOSshRNA 干扰质粒能有效阻断 T 细胞共刺激通路，抑制急性排斥反应，延长 移植肢体存活时间。正文内容正文内容第一部分质粒介导 shRNA 抑制大鼠淋巴细胞 ICOS 基因表达的实验研究 目的：构建抑制大鼠淋巴细胞 ICOS 基因表达 shRNA 的重组质粒，观察其对大鼠 淋巴细胞 ICOS 基因
6、及蛋白表达的影响。 方法：选择 4 个干扰位点，分别合 成 4 对干扰寡核苷酸，形成双链后构建于 pSilencer 4.1-CMV neo 质粒载体， 经阳离子脂质体介导转染大鼠淋巴细胞。转染后 48 小时，分别用半定量 RT- PCR 检测 ICOS 基因 mRNA 的抑制程度，流式细胞仪检测细胞表面 ICOS 表达水平。 单向混合淋巴细胞反应检测细胞的增殖能力，ELISA 法检测细胞因子 IFN- 和 IL-4 分泌水平。 结果：转染后 48h，实验组淋巴细胞 ICOS 的 mRNA 水平和 ICOS 分子表达明显低于对照组(Plt;0.05)，对照组间无明显差异。转染 干扰质粒的淋巴细
7、胞增殖能力明显降低，细胞因子 IFN- 和 IL-4 的含量也减 低。 结论：表达 shRNA 的干扰质粒可以抑制大鼠淋巴细胞 ICOS 基因的表达， 降低 T 淋巴细胞活化增殖能力，为进一步研究 RNA 干扰 ICOS 基因在移植免疫耐 受方面的应用提供了实验基础。 第二部分 RNA 干扰质粒抑制异体肢体移植急 性捧斥反应的实验研究 目的:研究 RNA 干扰阻断 ICOS 共刺激通路在大鼠异体 肢体移植急性排斥反应中的作用。 方法：采用改良肢体移植法行 Wistar 到 SD 大鼠肢体移植 27 例，分 3 组，每组 9 例。其中 A 组为排斥组，不给予特殊 处置；B 组为对照组，移植术后阴
8、茎背静脉注射梭华 Sofast-pSilencer 4.1 空 载体复合物；C 组为干扰组，移植术后注射梭华 Sofast-pSilencer 4.1- ICOSshRNA 干扰质粒复合物。术后第 8d 每组处死 SD 鼠 3 只，取组织行病理检 查，RT-PCR 及流式细胞仪检测体内 ICOS 表达水平，混合淋巴细胞反应及细胞 因子的检测。其余大鼠观察生存情况及肢体存活时间。结果：A 组平均存活时 间(11.341.11)d，B 组平均存活时间(11.141.32)d，C 组平均存活时间 (16.121.72)d(Plt;0.05)。A、B 组病理示中、重度急性排斥反应，C 组 急排反应轻微
9、。体内 ICOS 基因表达 C 组明显低于 A 组和 B 组。混合淋巴细胞反 应刺激指数 A 组 5.261.42，B 组 5.370.27，C 组 2.370.35(Plt;0.05)。C 组中细胞因子(IFN- 和 IF-4)的表达较 A、B 组均降低，但 IFN- 降低更显著。 结论:体内转染 pSilencer 4.1- ICOSshRNA 干扰质粒能有效阻断 T 细胞共刺激通路，抑制急性排斥反应，延长 移植肢体存活时间。 第一部分质粒介导 shRNA 抑制大鼠淋巴细胞 ICOS 基因表达的实验研究 目的： 构建抑制大鼠淋巴细胞 ICOS 基因表达 shRNA 的重组质粒，观察其对大鼠
10、淋巴细 胞 ICOS 基因及蛋白表达的影响。 方法：选择 4 个干扰位点，分别合成 4 对 干扰寡核苷酸，形成双链后构建于 pSilencer 4.1-CMV neo 质粒载体，经阳离 子脂质体介导转染大鼠淋巴细胞。转染后 48 小时，分别用半定量 RT-PCR 检测 ICOS 基因 mRNA 的抑制程度，流式细胞仪检测细胞表面 ICOS 表达水平。单向混 合淋巴细胞反应检测细胞的增殖能力，ELISA 法检测细胞因子 IFN- 和 IL-4 分泌水平。 结果：转染后 48h，实验组淋巴细胞 ICOS 的 mRNA 水平和 ICOS 分子表达明显低于对照组(Plt;0.05)，对照组间无明显差异
11、。转染干扰质 粒的淋巴细胞增殖能力明显降低，细胞因子 IFN- 和 IL-4 的含量也减低。 结论：表达 shRNA 的干扰质粒可以抑制大鼠淋巴细胞 ICOS 基因的表达，降低 T 淋巴细胞活化增殖能力，为进一步研究 RNA 干扰 ICOS 基因在移植免疫耐受方面 的应用提供了实验基础。 第二部分 RNA 干扰质粒抑制异体肢体移植急性捧斥反应的实验研究 目的:研究 RNA 干扰阻断 ICOS 共刺激通路在大鼠异体肢体移 植急性排斥反应中的作用。 方法：采用改良肢体移植法行 Wistar 到 SD 大鼠 肢体移植 27 例，分 3 组，每组 9 例。其中 A 组为排斥组，不给予特殊处置；B 组为
12、对照组，移植术后阴茎背静脉注射梭华 Sofast-pSilencer 4.1 空载体复合 物；C 组为干扰组，移植术后注射梭华 Sofast-pSilencer 4.1-ICOSshRNA 干扰 质粒复合物。术后第 8d 每组处死 SD 鼠 3 只，取组织行病理检查，RT-PCR 及流 式细胞仪检测体内 ICOS 表达水平，混合淋巴细胞反应及细胞因子的检测。其余 大鼠观察生存情况及肢体存活时间。结果：A 组平均存活时间(11.341.11) d，B 组平均存活时间(11.141.32)d，C 组平均存活时间(16.121.72) d(Plt;0.05)。A、B 组病理示中、重度急性排斥反应，C
13、 组急排反应轻微。 体内 ICOS 基因表达 C 组明显低于 A 组和 B 组。混合淋巴细胞反应刺激指数 A 组 5.261.42，B 组 5.370.27，C 组 2.370.35(Plt;0.05)。C 组中细 胞因子(IFN- 和 IF-4)的表达较 A、B 组均降低，但 IFN- 降低更显著。 结论:体内转染 pSilencer 4.1-ICOSshRNA 干扰质粒能有效阻断 T 细胞共刺激通 路，抑制急性排斥反应，延长移植肢体存活时间。 第一部分质粒介导 shRNA 抑制大鼠淋巴细胞 ICOS 基因表达的实验研究 目的： 构建抑制大鼠淋巴细胞 ICOS 基因表达 shRNA 的重组质
14、粒，观察其对大鼠淋巴细 胞 ICOS 基因及蛋白表达的影响。 方法：选择 4 个干扰位点，分别合成 4 对 干扰寡核苷酸，形成双链后构建于 pSilencer 4.1-CMV neo 质粒载体，经阳离 子脂质体介导转染大鼠淋巴细胞。转染后 48 小时，分别用半定量 RT-PCR 检测 ICOS 基因 mRNA 的抑制程度，流式细胞仪检测细胞表面 ICOS 表达水平。单向混 合淋巴细胞反应检测细胞的增殖能力，ELISA 法检测细胞因子 IFN- 和 IL-4 分泌水平。 结果：转染后 48h，实验组淋巴细胞 ICOS 的 mRNA 水平和 ICOS 分子表达明显低于对照组(Plt;0.05)，对
15、照组间无明显差异。转染干扰质 粒的淋巴细胞增殖能力明显降低，细胞因子 IFN- 和 IL-4 的含量也减低。 结论：表达 shRNA 的干扰质粒可以抑制大鼠淋巴细胞 ICOS 基因的表达，降低 T 淋巴细胞活化增殖能力，为进一步研究 RNA 干扰 ICOS 基因在移植免疫耐受方面 的应用提供了实验基础。 第二部分 RNA 干扰质粒抑制异体肢体移植急性捧斥 反应的实验研究 目的:研究 RNA 干扰阻断 ICOS 共刺激通路在大鼠异体肢体移 植急性排斥反应中的作用。 方法：采用改良肢体移植法行 Wistar 到 SD 大鼠 肢体移植 27 例，分 3 组，每组 9 例。其中 A 组为排斥组，不给予
16、特殊处置；B 组为对照组，移植术后阴茎背静脉注射梭华 Sofast-pSilencer 4.1 空载体复合 物；C 组为干扰组，移植术后注射梭华 Sofast-pSilencer 4.1-ICOSshRNA 干扰 质粒复合物。术后第 8d 每组处死 SD 鼠 3 只，取组织行病理检查，RT-PCR 及流 式细胞仪检测体内 ICOS 表达水平，混合淋巴细胞反应及细胞因子的检测。其余 大鼠观察生存情况及肢体存活时间。结果：A 组平均存活时间(11.341.11) d，B 组平均存活时间(11.141.32)d，C 组平均存活时间(16.121.72) d(Plt;0.05)。A、B 组病理示中、重度急性排斥反应，C 组急排反应轻微。 体内 ICOS 基因表达 C 组明显低于 A 组和 B 组。混合淋巴细胞反应刺激指数 A 组 5.261.42，B 组 5.370.27
