《脂蛋白肾病相关的一个新的载脂蛋白e基因突变及重组腺病毒载体的构建》由会员分享，可在线阅读，更多相关《脂蛋白肾病相关的一个新的载脂蛋白e基因突变及重组腺病毒载体的构建（27页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、内科学专业优秀论文内科学专业优秀论文 脂蛋白肾病相关的一个新的载脂蛋白脂蛋白肾病相关的一个新的载脂蛋白 E E 基因基因突变及重组腺病毒载体的构建突变及重组腺病毒载体的构建关键词：脂蛋白肾病关键词：脂蛋白肾病 肾小球疾病肾小球疾病 细胞病理学细胞病理学摘要：本研究对一个三代均有脂蛋白。肾病患者的完整家系进行研究，希望找 到中国脂蛋白肾病患者的 apoE 基因变异，并对此变异基因进行功能研究，进一 步阐明 apoE 基因变异在脂蛋白肾病发病机制中的作用。 第一部分脂蛋白肾 病相关新的载脂蛋白 E 基因突变的鉴定。通过分析包含 4 个脂蛋白肾病患者的 一个家系所有成员的载脂蛋白 E(apoE)基因
2、，寻找脂蛋白肾病相关的载脂蛋白 E 突变位点。询问全部家系成员的病史，并进行尿常规、血肌酐、血脂、血清 脂蛋白检查，抽提基因组 DNA，PCR 法扩增所有成员的 apoE 第 4 外显子，纯化 的 PCR 产物直接测序，并将经纯化后的 PCR 产物亚克隆至 pMD 18-T 载体，挑菌 落测序。4 例脂蛋白肾病患者和一位无症状直系亲属均为携带一种新的 apoE 点 突变的杂合子，150 号密码子发生点突变：CGCgt;CCC(由精氨酸变成脯 氨酸)，均伴有 apoE 的升高。 apoE 点突变 apoE Guangzhou(arg150 pro)可能 与该家系脂蛋白肾病的发病密切相关。 第二部
3、分重组 apoE Guangzhou 突变 基因腺病毒载体的构建。利用 AdEasy 腺病毒载体系统构建重组 apoE Wild、apoE Guangzhou 和 apoE sendai 腺病毒载体，为进一步研究 apoE Guangzhou 功能奠定工作基础。从脂蛋白肾病患者及正常人外周血白细胞提取 的总 RNA 中通过 PCR 的方法扩增出目的基因 apoE GLlangzhou 和 apoE Wild， 连接到 pMD18-T vector 上得到 apoEGuangzhou in pMD18-T vector 和 apoE Wild in pMDl8-T vector 质粒。以 apo
4、E Wildin pMD18-T vector 质粒为模板， 通过重叠延伸 PCR 定点诱变法构建 apoE sendaipMD18-T vector 质粒。双酶切 后连于 padtrack-CMV 中，得到的穿梭质粒 pAdTrack-apoE Wild、pAdTrack- apoE Guangzhou 和 pAdTrack-apoE Sendai 经酶切线性化后和腺病毒骨架质粒 AdEasyl 一起采用电穿孔转化到 BJ5183 大肠杆菌电感受态细菌中同源重组，利 用其卡那霉素抗性挑选同源重组质粒，用限制性内切酶 Pac 进行酶切鉴定。 经质粒测序证明成功将目的基因 apoe Wild、a
5、poE GLlangzhou 和 apoE sendai 装载在载体上，重组腺病毒载体(pAdEasy-GFP-apoE wild，pAdEasy-GFP-apoE Guangzhou andpAdEasy-GFP-apoE Sendai)经限制性内切酶检测得到正确片段。 提示成功地构建了携带 apoE Wild、apoe Guangzhou 和 apoE sendai 基因的重 组腺病毒载体。正文内容正文内容本研究对一个三代均有脂蛋白。肾病患者的完整家系进行研究，希望找到 中国脂蛋白肾病患者的 apoE 基因变异，并对此变异基因进行功能研究，进一步 阐明 apoE 基因变异在脂蛋白肾病发病机
6、制中的作用。 第一部分脂蛋白肾病 相关新的载脂蛋白 E 基因突变的鉴定。通过分析包含 4 个脂蛋白肾病患者的一 个家系所有成员的载脂蛋白 E(apoE)基因，寻找脂蛋白肾病相关的载脂蛋白 E 突变位点。询问全部家系成员的病史，并进行尿常规、血肌酐、血脂、血清脂 蛋白检查，抽提基因组 DNA，PCR 法扩增所有成员的 apoE 第 4 外显子，纯化的 PCR 产物直接测序，并将经纯化后的 PCR 产物亚克隆至 pMD 18-T 载体，挑菌落 测序。4 例脂蛋白肾病患者和一位无症状直系亲属均为携带一种新的 apoE 点突 变的杂合子，150 号密码子发生点突变：CGCgt;CCC(由精氨酸变成脯氨
7、 酸)，均伴有 apoE 的升高。 apoE 点突变 apoE Guangzhou(arg150 pro)可能与 该家系脂蛋白肾病的发病密切相关。 第二部分重组 apoE Guangzhou 突变基 因腺病毒载体的构建。利用 AdEasy 腺病毒载体系统构建重组 apoE Wild、apoE Guangzhou 和 apoE sendai 腺病毒载体，为进一步研究 apoE Guangzhou 功能奠 定工作基础。从脂蛋白肾病患者及正常人外周血白细胞提取的总 RNA 中通过 PCR 的方法扩增出目的基因 apoE GLlangzhou 和 apoE Wild，连接到 pMD18-T vecto
8、r 上得到 apoEGuangzhou in pMD18-T vector 和 apoE Wild in pMDl8-T vector 质粒。以 apoE Wildin pMD18-T vector 质粒为模板，通过重叠延伸 PCR 定点诱变法构建 apoE sendaipMD18-T vector 质粒。双酶切后连于 padtrack- CMV 中，得到的穿梭质粒 pAdTrack-apoE Wild、pAdTrack-apoE Guangzhou 和 pAdTrack-apoE Sendai 经酶切线性化后和腺病毒骨架质粒 AdEasyl 一起采用电 穿孔转化到 BJ5183 大肠杆菌电感
9、受态细菌中同源重组，利用其卡那霉素抗性挑 选同源重组质粒，用限制性内切酶 Pac 进行酶切鉴定。经质粒测序证明成功 将目的基因 apoe Wild、apoE GLlangzhou 和 apoE sendai 装载在载体上，重组 腺病毒载体(pAdEasy-GFP-apoE wild，pAdEasy-GFP-apoE Guangzhou andpAdEasy-GFP-apoE Sendai)经限制性内切酶检测得到正确片段。提示成功地 构建了携带 apoE Wild、apoe Guangzhou 和 apoE sendai 基因的重组腺病毒载 体。 本研究对一个三代均有脂蛋白。肾病患者的完整家系进
10、行研究，希望找到中国 脂蛋白肾病患者的 apoE 基因变异，并对此变异基因进行功能研究，进一步阐明 apoE 基因变异在脂蛋白肾病发病机制中的作用。 第一部分脂蛋白肾病相关 新的载脂蛋白 E 基因突变的鉴定。通过分析包含 4 个脂蛋白肾病患者的一个家 系所有成员的载脂蛋白 E(apoE)基因，寻找脂蛋白肾病相关的载脂蛋白 E 突变 位点。询问全部家系成员的病史，并进行尿常规、血肌酐、血脂、血清脂蛋白 检查，抽提基因组 DNA，PCR 法扩增所有成员的 apoE 第 4 外显子，纯化的 PCR 产物直接测序，并将经纯化后的 PCR 产物亚克隆至 pMD 18-T 载体，挑菌落测序。 4 例脂蛋白
11、肾病患者和一位无症状直系亲属均为携带一种新的 apoE 点突变的杂 合子，150 号密码子发生点突变：CGCgt;CCC(由精氨酸变成脯氨酸)， 均伴有 apoE 的升高。 apoE 点突变 apoE Guangzhou(arg150 pro)可能与该家系 脂蛋白肾病的发病密切相关。 第二部分重组 apoE Guangzhou 突变基因腺病 毒载体的构建。利用 AdEasy 腺病毒载体系统构建重组 apoE Wild、apoE Guangzhou 和 apoE sendai 腺病毒载体，为进一步研究 apoE Guangzhou 功能奠定工作基础。从脂蛋白肾病患者及正常人外周血白细胞提取的总
12、RNA 中通过 PCR 的方法扩增出目的基因 apoE GLlangzhou 和 apoE Wild，连接到 pMD18-T vector 上得到 apoEGuangzhou in pMD18-T vector 和 apoE Wild in pMDl8-T vector 质粒。以 apoE Wildin pMD18-T vector 质粒为模板，通过重叠延伸 PCR 定点诱变法构建 apoE sendaipMD18-T vector 质粒。双酶切后连于 padtrack- CMV 中，得到的穿梭质粒 pAdTrack-apoE Wild、pAdTrack-apoE Guangzhou 和 pA
13、dTrack-apoE Sendai 经酶切线性化后和腺病毒骨架质粒 AdEasyl 一起采用电 穿孔转化到 BJ5183 大肠杆菌电感受态细菌中同源重组，利用其卡那霉素抗性挑 选同源重组质粒，用限制性内切酶 Pac 进行酶切鉴定。经质粒测序证明成功 将目的基因 apoe Wild、apoE GLlangzhou 和 apoE sendai 装载在载体上，重组 腺病毒载体(pAdEasy-GFP-apoE wild，pAdEasy-GFP-apoE Guangzhou andpAdEasy-GFP-apoE Sendai)经限制性内切酶检测得到正确片段。提示成功地 构建了携带 apoE Wil
14、d、apoe Guangzhou 和 apoE sendai 基因的重组腺病毒载 体。 本研究对一个三代均有脂蛋白。肾病患者的完整家系进行研究，希望找到中国 脂蛋白肾病患者的 apoE 基因变异，并对此变异基因进行功能研究，进一步阐明 apoE 基因变异在脂蛋白肾病发病机制中的作用。 第一部分脂蛋白肾病相关 新的载脂蛋白 E 基因突变的鉴定。通过分析包含 4 个脂蛋白肾病患者的一个家 系所有成员的载脂蛋白 E(apoE)基因，寻找脂蛋白肾病相关的载脂蛋白 E 突变 位点。询问全部家系成员的病史，并进行尿常规、血肌酐、血脂、血清脂蛋白 检查，抽提基因组 DNA，PCR 法扩增所有成员的 apoE
15、 第 4 外显子，纯化的 PCR 产物直接测序，并将经纯化后的 PCR 产物亚克隆至 pMD 18-T 载体，挑菌落测序。 4 例脂蛋白肾病患者和一位无症状直系亲属均为携带一种新的 apoE 点突变的杂 合子，150 号密码子发生点突变：CGCgt;CCC(由精氨酸变成脯氨酸)， 均伴有 apoE 的升高。 apoE 点突变 apoE Guangzhou(arg150 pro)可能与该家系 脂蛋白肾病的发病密切相关。 第二部分重组 apoE Guangzhou 突变基因腺病 毒载体的构建。利用 AdEasy 腺病毒载体系统构建重组 apoE Wild、apoE Guangzhou 和 apoE
16、 sendai 腺病毒载体，为进一步研究 apoE Guangzhou 功能奠 定工作基础。从脂蛋白肾病患者及正常人外周血白细胞提取的总 RNA 中通过 PCR 的方法扩增出目的基因 apoE GLlangzhou 和 apoE Wild，连接到 pMD18-T vector 上得到 apoEGuangzhou in pMD18-T vector 和 apoE Wild in pMDl8-T vector 质粒。以 apoE Wildin pMD18-T vector 质粒为模板，通过重叠延伸 PCR 定点诱变法构建 apoE sendaipMD18-T vector 质粒。双酶切后连于 padtrack- CMV 中，得到的穿梭质粒 pAdTrack-apoE Wild、pAdTrack-apoE Guangzhou 和 pAdTrack-apoE Sendai 经酶切线性化后和腺病毒骨架质粒 AdEasyl 一起采用电 穿孔转化到 BJ5183 大肠杆菌电感受态细菌中同源重组，利用其卡那霉素抗性挑
