《胸腺融合肽tα1-tp5的表达、纯化和活性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《胸腺融合肽tα1-tp5的表达、纯化和活性研究（24页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、微生物与生化药学专业优秀论文微生物与生化药学专业优秀论文 胸腺融合肽胸腺融合肽 T1-TP5T1-TP5 的表达、纯的表达、纯化和活性研究化和活性研究关键词：关键词：T1-TP5T1-TP5 融合肽融合肽 胸腺肽胸腺肽 11 胸腺五肽胸腺五肽 基因表达基因表达 分离纯化分离纯化 生物学活生物学活 性性摘要：胸腺五肽（thymopentin，TP5）是位于胸腺生成素的第 3236 位氨基 酸残基片段，具有与 TP相似的生物学活性，能双向调节失衡的免疫系统。 TP5 能诱导 T 细胞的分化，促进 T 淋巴细胞亚群发育并活化，是一种重要的免 疫调节剂，临床上主要用于免疫缺陷症和自身免疫性疾病的治疗。
2、因 TP5 半衰 期较短（30 s） ，人们制备了许多 TP5 的类似物或模拟肽来延长 TP5 的半衰期并 提高其活性，如在 TP5 之间插入稳定性成分、用 D-型氨基酸取代 L-型氨基酸， 或者制成环肽等，尽管这些工作取得了一定的成绩，但结果却难以令人满意。 T1 是一种天然存在于多种生物组织的多肽物质，由 28 个氨基酸残基组成， 等电点 4.2，分子量 3108 Da。T1 具有与 TP5 类似的免疫活性，主要是增强 细胞免疫，用于免疫缺陷或免疫功能低下相关的疾病。T1 的血浆半衰期约 1.5 h。目前，T1 主要从动物组织中提取或化学合成，但从组织中提取存在 产量低、产物不稳定等缺点，
3、而化学合成则价格昂贵。 为了提高 TP5 的活性， 延长其半衰期，本研究依据肽链延长可提高多肽类药物体内半衰期的事实，将 具有相似生物活性与临床用途的 TP5 和 T1 借助基因工程方法连接在了一起， 表达制备了 T1-TP5 融合肽。 1、T1-TP5 融合肽的基因克隆及在毕赤酵 母中的表达 本研究根据 T1-TP5 的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏爱的密码 子，人工设计合成了 T1-TP5 全基因序列；借助 Primer 软件，设计了上下游 引物，通过 PCR 反应、酶切、连接等步骤，构建了融合基因 T1-TP5 表达载体 pGAPZA-T1-TP5。 由于在毕赤酵母中表达融合肽可能出现 N-
4、端和 c-端不 均一的现象，在构建表达载体时时采取了两种方法：第一，将目的基因直接插 在 -信号肽后面的 Glu-Ala-Glu-Ala 处；第二，在目的基因 C-端增加了凝血 酶酶切位点的编码基因，保留了 6His 纯化标签。这样，既能简便快捷的用金 属鳌合亲和填料纯化表达产物，又能通过凝血酶高效完全地切除 N-端多余氨基 酸残基和 6His 标签，得到 T1-TP5 融合肽，从而提高 T1-TP5 融合肽的纯 化效率。 采用电激法用 Bln线性化载体 pGAPZA-T1-TP5 转化 P.pastoris GS115，筛选 Zeocine 高抗性的阳性克隆，用煮-冻-煮法提取酵母 基因组
5、DNA，用 PCR 方法对 P.pastoris GS115 的基因表型进行了鉴定。重组转 化子经摇瓶培养，Tricine-SDS-PAGE 证明上清液中含有 T1-TP5 融合肽，其 中两个转化子表达量较高。考查了发酵时间、培养温度对 T1-TP5 融合肽表达 量的影响。结果显示，在 30、72 h 后发酵上清中的 T1-TP5 表达量最高， 达 32.2 mg/L。 2、T1-TP5 融合肽的分离纯化 研究了 T1-TP5 融合肽 的分离纯化工艺。发酵混合物经高速离心取上清，用超滤法去除大分子的蛋白 酶、金属螯和层析纯化融合肽、冷冻干燥浓缩、SephadexG-25 凝胶过滤脱盐、 凝血酶
6、酶切后用 SephadexG-70 凝胶过滤分离，再干燥浓缩，目的产物 T1- TP5 融合肽在 Tricine-SDS-PAGE 上呈现单一条带。ESI-MS 也证实了 T1-TP5 融合肽在毕赤酵母中得到正确的分泌表达。 3、T1-TP5 融合肽的二级结构 研究 利用圆二色谱（Circular Dichroism，CD）与傅立叶变换红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy， FTIR）对 T1-TP5 融合肽的 二级结构进行了分析。CD 结果显示 T1-TP5 融合肽中二级结构的各构象分别 是 -helix 为 32.01，-antipara
7、llel 为 8.50，-parallel 为 8.86，-turn 为 17.02，random coil 为 33.61，说明 T1-TP5 融合肽 分子结构中，-helix 和 random coil 是二级结构的主要部分。该结果 FTIR 的分析结果基本一致，二种分析方法相互补充，相互印证。 4、T1-TP5 融 合肽体外半衰期的研究 从家兔心脏取血后进行肝素抗凝，加入一定浓度的多 肽药物，37水浴，于不同的时间点取样，用盐酸丙酮（盐酸：丙酮：水 =1：40：5，v/v）对血浆样品进行处理，高速离心得到沉淀，用醋酸溶解。用 RP-HPLC 测定不同保温时间血浆中 T1-TP5、T1 及
8、 TP5 的浓度，计算 T1- TP5、T1 及 TP5 体外血浆半衰期。结果表明，T1-TP5、T1 及 TP5 的血浆 半衰期分别为 14014 min、12711 min 和 5.60.7 min。T1-TP5 融合肽 较 TP5 的体外血浆半衰期有明显差异（P0.01） 。 5、T1-TP5 融合肽的活 性研究 小鼠脾细胞增殖实验表明，在系列浓度为 10-11106mol/L 时， Tl-TP5 融合肽对昆明小鼠脾淋巴细胞的的最大增殖率为 50.975.19，T1 的最大增殖率为 45.388.26，TP5 融合肽的最大增殖 率为 40.615.17，T1-TP5 融合肽与 TP5 之
9、间有显著性差异 （plt;0.01） 。 在巨噬细胞的吞噬实验中，T1-TP5 融合肽组、T1 组、TP5 组和对照组的廓清指数 K 分别为 0.0200.0010、0.0160.0007、0.0130.0008 和 0.0050.0006，而对应的 吞噬指数依次为 3.950.19、3.730.56、3.430.29 和 2.480.40。结果 表明，各药物组均能影响正常小鼠单核巨噬细胞吞噬功能，且融合肽的廓清指 数 K 和吞噬指数 也显著高于其它组（Plt;0.01） 。 通过研究 T1- TP5、T1 和 TP5 对小鼠血清中 IL-2 的表达的影响表明，T1-TP5 融合肽组的 平均水
10、平为 848.8146.70 pg/mL，T1 组的平均水平为 761.5031.33 pg/mL，而 TP5 组的平均水平为 749.6229.08 pg/mL，对照组为 718.3532.16 pg/mL，融合肽较其它实验组有显著性差异（Plt;0.01） 。 这表明 T1-TP5 融合肽较 T1 和 TP5 能更有效地促进淋巴细胞分泌 IL-2。 考虑到 T1-TP5 融合肽的结构与功能的关系，认为 T1-TP5 融合肽免疫活性 的提高是由于 T1-TP5 构象的微小变化，尤其是 -helix 含量的升高引起的。 因为 -helix 被认为是 T1 的主要活性中心，-helix 含量的升
11、高，不仅显 著延长了 T1-TP5 融合肽的半衰期，而且 T1-TP5 融合肽与靶细胞的持久作 用更有利于免疫活性的增强。 本实验结果表明，T1-TP5 融合肽具有潜在 的临床应用价值。 本研究取得的主要成果有： （1）构建了 pGAPZA- T1-TP5 表达载体，并采用毕赤酵母表达系统对 T1-TP5 融合肽进行了分泌 表达，表达量可达 32.2 mg/L，用 ESI-MS 证实了其结构的正确性。 （2）建 立了实验室水平的 T1-TP5 融合肽分离纯化工艺，经过超滤、亲和层析和凝胶 过滤三步骤，所获得产品的纯度可达到 99以上。 （3）用 CD 和 FTIR 研究 了 T1-TP5 融合
12、肽的二级结构，表明 -helix 和 random coil 是其二级结构 的主要组成部分。推测 T1-TP5 融合肽二级结构中的 -helix 构象是影响其 活性的重要因素。 （4）与 TP5 和 T1 相比较进行了 T1-TP5 融合肽体外血 浆 t1/2 研究，显示 T1-TP5 融合肽的半衰期约为 14014 min，高于同比试 验 TP5（5.60.7 min）和 T1（12711min） 。 （5）进行了胸腺 T1-TP5 融合肽体内外免疫活性研究，表明融合肽 T1-TP5 在促进昆明小鼠脾细胞的增殖、增加巨噬细胞的吞噬功能，和促进 IL-2 表达的实验中均显示了比 TP5 和 T
13、1 更高的活性，是一个活性较好的潜在的免疫调节药物。 本研究为一种 新型免疫调节剂的开发奠定了基础。正文内容正文内容胸腺五肽（thymopentin，TP5）是位于胸腺生成素的第 3236 位氨基酸 残基片段，具有与 TP相似的生物学活性，能双向调节失衡的免疫系统。TP5 能诱导 T 细胞的分化，促进 T 淋巴细胞亚群发育并活化，是一种重要的免疫调 节剂，临床上主要用于免疫缺陷症和自身免疫性疾病的治疗。因 TP5 半衰期较 短（30 s） ，人们制备了许多 TP5 的类似物或模拟肽来延长 TP5 的半衰期并提高 其活性，如在 TP5 之间插入稳定性成分、用 D-型氨基酸取代 L-型氨基酸，或者
14、 制成环肽等，尽管这些工作取得了一定的成绩，但结果却难以令人满意。 T1 是一种天然存在于多种生物组织的多肽物质，由 28 个氨基酸残基组成， 等电点 4.2，分子量 3108 Da。T1 具有与 TP5 类似的免疫活性，主要是增强 细胞免疫，用于免疫缺陷或免疫功能低下相关的疾病。T1 的血浆半衰期约 1.5 h。目前，T1 主要从动物组织中提取或化学合成，但从组织中提取存在 产量低、产物不稳定等缺点，而化学合成则价格昂贵。 为了提高 TP5 的活性， 延长其半衰期，本研究依据肽链延长可提高多肽类药物体内半衰期的事实，将 具有相似生物活性与临床用途的 TP5 和 T1 借助基因工程方法连接在了
15、一起， 表达制备了 T1-TP5 融合肽。 1、T1-TP5 融合肽的基因克隆及在毕赤酵 母中的表达 本研究根据 T1-TP5 的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏爱的密码 子，人工设计合成了 T1-TP5 全基因序列；借助 Primer 软件，设计了上下游 引物，通过 PCR 反应、酶切、连接等步骤，构建了融合基因 T1-TP5 表达载体 pGAPZA-T1-TP5。 由于在毕赤酵母中表达融合肽可能出现 N-端和 c-端不 均一的现象，在构建表达载体时时采取了两种方法：第一，将目的基因直接插 在 -信号肽后面的 Glu-Ala特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换 码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供代笔服务，价格优惠，服务周到， 包您通过。“垐垯櫃换烫梯葺铑? endstream endobj 2x 滌甸?*U 躆跦?l,墀 VGi?o 嫅#4K 錶 c #x刔彟 2Z 皙笜?D剧珞 H 鏋 Kx 時 k,褝仆? 稀?i 攸闥-) 荮vJ 釔絓|?殢 D 蘰厣?籶(柶胊?07 姻R
