棉纤维细胞壁超微结构的原子力显微镜分析1王禄山1,2，高培基 1，时东霞2, 张玉忠11山东大学微生物技术国家重点实验室，济南，(250100) 2中国科学院物理研究所纳米物理与器件实验室，北京，(100080) E-mail: Lswang@, Zhangyz@摘 要：摘 要：纤维素类生物质的超分子结构具有异质性的特点，其复杂性的结构是生物质转化利用研究的主要障碍利用原子力显微镜观察棉纤维细胞壁的切面与表面超微结构，发现其基本结构单元——微纤丝排列存在两种方式：一种是交织排列，符合“缨状”微纤结构模型；另一种呈笔直平行有序排列不同排列方式的微纤丝对纤维素酶的敏感程度不同，交织排列的微纤丝易于完全降解，而平行排列的微纤丝为分段降解微纤丝结构的不均一性和不同集聚方式是棉纤维三维结构产生异质性的主要原因，而其特征及变化可以利用表面粗糙度参数进行表征；纤维素结构在纳米层次上的定性定量表征将对其酶解转化过程的相关研究产生重要影响 关键词：关键词：微纤丝，超微结构，异质性，原子力显微镜 1. 引引 言言 纤维素是自然界中最丰富的有机质，自然界每年光合作用产物的量约为 1011 吨，是重要的可再生能源物质[1]。
纤维素是由葡萄糖分子通过β-1，4 糖苷键连接而成的线性高分子，化学组成相对简单，但由于葡萄糖分子链间及链内存在大量氢键，使其聚集形成微纤丝、纤丝及纤维等多层次、聚集态结构，即纤维素超分子结构纤维素的物理、化学性质不仅取决于其化学组成，更取决于其超分子结构，多层次复杂的超分子结构导致了化学反应可及性的不均一和酶解反应的复杂性，这是导致酶解效率低、难于制备精细化工产品的重要原因[2] 纤维素结构的研究：一是整体水平，一是超微结构水平[1]整体水平的分析主要是进行晶体学和光谱学的测定及分析 在天然纤维素中存在的晶体为纤维素 I， 它含有两种晶态，占优势的三斜晶胞 Iα和少量的单斜晶胞 Iβ [3, 4]进一步研究表明 Iα是亚稳态的，在退火时向着 Iβ转变 [5]；不同的纤维素样品中，两晶态的含量不同，并且同一微纤丝中两种晶态含量也是变化的[4]在很长的一段时间内，纤维素晶体二态性的存在对其结构的解析造成了很大困难纯 Iα与 Iβ的发现为结晶纤维素原子级分辨率的解析奠定了基础[6,7]，13C 固态 NMR 谱测定表明 Iα与 Iβ都存在两种构象不同的吡喃葡萄糖残基[8]应用同步加速器及中子衍射技术测定单一晶态的纤维素微晶结构表明， 纤维素 Iα与 Iβ两晶胞结构都由两条平行链组成，链之间都有轻微不同的构象，链间的分子间氢键也不完全相同[9.10]。
超微结构水平的测定主要应用显微技术，应用透射电镜（TEM）发现纤维素的结构单元是微1 本课题得到国家自然科学基金（批准号：30270022）、教育部博士点基金（批准号：20020422054）及山东省自然科学基金（批准号：Z2002D03）资助项目的课题资助 - 1 - 纤丝，进而获得高分辨率的纤维素晶格图像[11]扫描探针显微镜（SPM）技术可以直接观测生物大分子的结构并可获得三维尺度上原子级的分辨率[12]，从而获得真实的表面超微结构张玉忠等用扫描隧道显微镜（STM）在大气状态下直接观察到微纤丝中存在亚结构——基元纤丝[13]，Baker[14,15]等用原子力显微镜（AFM）观测 Valonia 晶体纤维素表面，获得了近原子分辨率的结构，对比分析晶体学测定的结构模型发现纤维表面存在着重构现象 结晶纤维素结构的解析大大提高了人们对纤维素的认识水平，然而，天然的纤维素结构中除了结晶区域外，还存在大量的具有异质性的非晶区域，这些结构特征还远未获得解析[16,17]由于纤维素降解过程第一步反应是酶分子与纤维素表面的结合，所以纤维素表面结构的异质性必然导致酶分子空间结构的多样性，即降解酶组分的多样性；天然纤维素结构的测定及认识水平也就影响到降解酶的吸附动力学及催化反应动力学研究进展[2, 18, 19]。
因此，建立天然纤维素超分子结构特性的定量分析方法，对研究生物质转化过程中酶解反应动力学、酶组分之间的协同及反应机理具有重要意义 棉纤维细胞壁的纤维素含量高达 95%以上，不含木素等其它成分，表面吸附的类脂、色素等杂质也很容易除去，所以棉纤维是天然纤维素超分子结构研究较好的材料，本文即对其超微结构进行观察分析 2. 材料与方法材料与方法 2.1 样品制备样品制备 棉纤维为鲁棉 11 号，样品由山东省农业科学院棉花研究中心提供样品处理过程：①把棉纤维样品悬浮于无水乙醇中洗涤，吸取 20µl，滴于新揭开的云母片上，风干②经过无水乙醇处理的棉纤维，用树脂包埋，用超薄切片机切片③棉纤维样品, 加入纤维素酶粗提液，缓冲液为 50mM NaAc，pH 为 4.8，40℃下处理 6 天，加入 0.1%NaCN3防腐处理完成后用蒸馏水洗涤三次，吸取 20µl，滴于新揭开的云母片上，风干 2.2 纤维素酶粗提液的制备纤维素酶粗提液的制备 同文献[20] 2.3 原子力显微镜（原子力显微镜（AFM）） 美国 DI 公司 NanoScope IIIa multimode 原子力显微镜，成像模式为轻敲模式，扫描速率为 0.5-1Hz，针尖为 DI 公司配备的 tapping mode 的针尖（硅针尖），同时记录高度像和相位像，图像没有进行滤波等处理。
2.4 超微图像的结构分析超微图像的结构分析 每一样品选用至少 10 幅图像（不同纤维，不同区域）进行分析，扫描范围基本一致每幅照片的粗糙度分析（Roughness analysis）用 Nanoscope III (Ver 4.42r8, Veeco Ins)软件完成，提取均方根粗糙度（RMS roughness，Rq）参数[21]. - 2 - ∑∑ ===NjMiJiqyxZMNR112),(1其中，Rq 为均方根粗糙度，M，N 是分别是 X，Y 方向上的取样点数，Z 为相应点的高度值 2.5 X 光粉末衍射（光粉末衍射（XRD）测定棉纤维结构的变化）测定棉纤维结构的变化 XRD采用RIGAKURADI系统衍射仪 （D/max-rB， 日本） ， Cu/Ka α放射源的波长0.154nm,在电流 30mA， 电压 40KV 下记录光谱， 纤维素结晶度 CrI%根据 Segal 提出的方程计算[22] CrI%=(ICr-Iam)/ICr% ICr指的是 002 处的峰强度（即 2θ=22°处峰），Iam指 2θ=18°处的峰强度ICr峰对应的是结晶区的强度，Iam峰对应的是无定形区的强度。
3. 结果与讨论结果与讨论 3．．1 棉纤维细胞壁结构切片观察棉纤维细胞壁结构切片观察 图 1 为棉纤维超薄切片表面形貌，图 1A 为切面的高度像，超薄切片截面较平，高度起伏不大，但能够从中分辨出微纤丝的断面形状；图 1B 为同时获取的相位像，根据相位像成像的原理，它能够区分高度相同但性质不同的物质的表面特征[23, 24]由于包埋树脂与微纤丝的组成及性质明显不同，所以相位像具有更为清晰的图像图 1B 中清楚地显示微纤丝的形状及空间的堆积排列方式，微纤丝截面形状较不规则，直径约 10-50nm，较细的微纤丝近圆形或椭圆形，较粗的微纤丝为扁平形状微纤丝在空间的堆积排列是分层的，层与层之间紧密结合该结果与透射电镜（TEM）结果相似[11]，不同之处在于 TEM 观察到的是重金属复染后反衬的“间接”形貌，其结果受到超薄切片厚度的直接影响，这增加了操作和观察分析时的难度 B A Fig.1 ultrastructure of cross section of cotton fiber (bar=200nm) A. Height image; B. phase image,. The double-headed arrows shown in images indicate the layer of cell wall. - 3 - 利用树脂包埋的超薄切片，结合 AFM 的相位像技术的特点，在未经染色的情况下很容易就获得 TEM 的分辨率，放大过程中图像也很稳定，并且观测的结果更接近于天然状态下微纤丝的真实形貌。
通过 AFM 图像分析进一步确证：棉纤维细胞壁中基本的结构单元是微纤丝，微纤丝中纤维素晶体结构并不完美[25]，存在异质性结构，这丰富了 Jocelyn 等提出的植物细胞初生壁中纤维素-木素网络结构模型[31]因此，切片技术与 AFM 相位像技术的结合是分析样品内部结构较好的技术 3．．2 棉纤维表面的定量分析棉纤维表面的定量分析 A B II I Fig.2 ultrastructure of surface of cotton fiber (bar=4000nm) A. Height image. The double-headed arrows shown in images indicate the direction of the fibers. The microfibrils are packed in cross fashion in Region I, and in parallel fashion in Region II. B. Phase image. 棉纤维表面的脂类、色素等成分经乙醇处理后可以除去，因此 AFM 可直接观察分析棉纤维表面的结构通过分析大量表面结构发现微纤丝存在两种明显不同的排列方式：一种为微纤丝交织排列，一种是微纤丝平行排列（图 2）。
交织排列的微纤丝多在最外层，而平行排列的区域多位于内层平行排列的区域表面还存在部分微纤丝片段，这些片段的排列方向与下层有序排列的微纤丝相互垂直，对稳定棉纤维结构有重要作用 3．．2．．1 微纤丝交织排列区域微纤丝交织排列区域 进一步放大微纤丝交织排列区域（图 3A）显示微纤丝聚集成束，微纤丝束存在分叉/聚集、弯曲现象，微纤丝上存在“结状”结构，这与其它报道的结果相似[26, 27]微纤丝交织排列的区域表面起伏较大，粗糙度较高，为 12.6nm（表 1）每根微纤丝束约有 3-10 根微纤丝组成，微纤丝的直径约 20-50nm一根微纤丝可以穿梭于不同的微纤丝束之间对一根微纤丝进行切面分析（图 3B）显示微纤丝表面起伏较大（约 50nm），存在明显的结状结构，可能是合成过程环境变化影响所致[28]纤维素中葡萄糖分子链不存在支链，同一微纤丝中出现高度/粗度的变化，应为超分子构象变化的反映，这表明分子链的空间结构具有- 4 - 明显不均一性 4060801001201400200400600 XY(nm)Z(nm)B A Fig.3 ultrastructure of microfibrils in cross fashion (bar=168nm) A. Height image. The double-headed arrows shown in images indicate the direction of the microfibrils. B. The cross section analysis along one microfibril. Table 1 surface roughness analysis of ultrastructure of cotton fibre surface* Surface region Cross region Parallel region Degradation region RMS roughness /nm 12．6±1.2 1．2±0.2 2．9±。