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1、1 2 1 3 中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：堑身缸! 日期：笸：2中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学本人
2、保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阆。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手论文作者签名：指导教师签名：实验仪器( 1 ) 超净工作台Y J 1 4 5 0 B 苏州金燕净化设备厂( 2 ) 离心机T D L 广5 - A 低速台式大容量离心机上海安亭科学仪器厂R D - 2 0 1 I I 高速冷冻离心机日本东京T o m yS e i k oC o L T D( 3 ) 层析装置L K B
3、B r o m m a2 0 2 3m i n i e o l d l a b 瑞典L K B 公司S L - 1 层析柜军事医学科学院( 4 ) c 0 2 培养箱美国F o r m a 公司( 5 ) 电泳仪D Y Y - I I l 5 型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂B i o - r a d 美国( 6 ) 水浴锅江苏省金坛市医疗仪器厂恒温箱P Y X - D H S 型上海跃进医疗仪器厂( 8 ) 冰箱- 2 0 冰箱B C D - 2 6 0 型新飞电器8 0 冰箱M D F - 3 8 2 E 日本三洋电器( 9 ) 显微镜X S ZD 2 生物倒置显微镜重庆光学仪器厂( 1 0
4、 ) 液氮生物冻存罐航空工业部豫新机械厂( 1 1 ) 纯水系统S z 9 3 自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂( 1 2 ) 冷冻真空干燥器A l p h a - 6 美国q h r i s ts e r v i c e( 1 2 ) 除菌滤器上海瑞利分离仪器厂( 1 3 ) 高压灭菌锅Z D X - 3 5 B I 型上海申安医疗器械厂。日本S A N Y O2 人c d l 4 7 的克隆、表达、纯化以其功能研究刖置C D l 4 7 EM P R I N 是一个肿瘤细胞表面的基质金属蛋白酶诱导因子，在正常组中起着非常重要的作用，尤其在体内外恶性肿瘤细胞表面高表达。大量的研究表明，C
5、 D l 4 7 是一个肿瘤细胞表面相关的因子，可通过成纤维细胞刺激合成基质金属蛋白酶，与肿瘤的生长和浸润有关。C D l 4 7 刺激M M P s 产生的信号传递途径将会是今后研究的热点之一。近来，M M P s 抑制剂和肿瘤血管新生抑制剂已进入期临床实验阶段，而作为其上游分子的C D l 4 7 ，相信阻断其表达或功能将更有效地抑制肿瘤的发展。本实验旨在研究C D l 4 7 分子在大肠癌转移中的作用和在大肠癌中的表达情况，以深入了解大肠癌以及大肠癌病理分期和C D l 4 7 分子间的关系，填补该研究领域空白，为进一步研究大肠癌的转移机理以及筛选大肠癌的特异分子标记物奠定基础。3 材料
6、和方法1 细胞和细胞培养：大肠癌细胞株C C L - 2 2 9 、C X - 1 、C C L 1 8 7 和C l o n e A 均培养于含1 0 小牛血清的D M E M 中；稳定转染后的C C L - 2 2 91 4 7 细胞株在含有2 0 0 p g m l G 4 1 8 的l O 小牛血清的D M E M 中培养。大肠杆菌株B L - 2 1 、D H 5 - a 及转化后的菌株均培养于含有相应抗生素的L B 培养液中。2 p E G F P 1 4 7 和p G E x - 5 x 1 4 7 重组载体的构建：以人e D N A 为模板，分别通过不同的引物经P C R 扩增
7、c d l 4 7 基因，在其5 和3 - 分别含有X b a I 、E c , o R I 和X h o I 、E c o R I 的酶切位点。以限制性内切酶X b a I 、E c o R I和X h o I 和E c o R l 分别消化经琼脂糖凝胶回收纯化的P C R 产物及p E G F P - - c l 、p G E X - 5 x - 3 两种载体，将片段回收后经T 4D N A 连接酶连接以后形成重组载体。转化后经菌落P C R 筛选阳性菌落。扩大培养阳性菌落、提取质粒，以双酶切法对重组载体进行鉴定，对鉴定正确的克隆采用S a n g e r 双脱氧末端终止法进行序列测定。并
8、对结果进行生物信息学分析。3 原核和真核表达体系的建立以及表达产物提纯：将p G E X - 5 x 1 4 7重组载体转化至表达菌株B L - 2 1 中，经过筛选以后，挑取阳性克隆培养，用合适浓度I F F G 诱导表达，电泳检测，将表达正确的克隆扩大培养，收集菌体破碎，然后用G S T 偶联的柱子提纯表达蛋白；将p E G F P - 1 4 7重组载体用L i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 试剂转染入C C L - 2 2 9 细胞中，通过G 4 1 8筛选出稳定表达的细胞株，然后大量培养，破碎细胞，用常规层析方法对表达产物进行提纯。4 提纯产物的功能研究：
9、将提纯的C D l 4 7 加入原代培养的人成纤维细胞中，用明胶电泳检测M V I P s 的表达情况；通过E L I S A 和P A G E4 以及W e s t o n B l o t 阐述C D l 4 7 的作用方式；通过T r a n s w e l l 和软琼脂培养试验，检测转染前后的C C L - 2 2 9 的穿膜率和克隆形成数的变化。5 C D l 4 7 在大肠癌中的表达：用免疫组织化学S P 方法，对临床的4 8 例大肠癌组织中C D l 4 7 的表达进行了检测。结果1 表达产物对人成纤维表达 k l l V I P $ 的影响：原核和真核表达产物经过提纯后，加入原代
10、培养的人成纤维细胞体系中，然后收集成纤维细胞进行明胶电泳，原核表达产物不能刺激I V I E S 的表达，而真核表达的C D l 4 7 能够刺激I V M P s 的表达，同时，C 6 3 4 T 的突变也没有影响C D l 4 7的定位和功能，通过数字生物信息学软件模拟，也没有发现这个位置的突变造成了太大的影响。2 C D l 4 7 的作用方式和对细胞的影响：通过E L I S A 试验，在几种大肠癌细胞的培养上清中没有发现有C D l 4 7 的检出；C C L - 2 2 9 的培养上清浓缩物加入成纤维细胞培养体系中，不能刺激成纤维细胞产生M V I P s 。转染后的C C L -
11、 2 2 9 细胞与正常的C C L - 2 2 9 相比，穿过T r a n s w e l l 膜的能力有显著提高，而且在软琼脂实验中的克隆形成数也有明显提高。3 C D l 4 7 在大肠癌中的表达：C D l 4 7 在粘液腺癌、乳头状腺癌和管状腺癌中的表达率分别为5 0( 3 6 ) 、5 3 8 ( 7 1 3 ) 和4 1 A ( 1 2 2 9 ) ，各组间阳性表达率无统计学意义( p o 0 5 ) ；C D l 4 7 在有淋巴结转移组与无淋巴结转移组的表达率分别为7 0 8 ( 1 7 2 4 ) 和3 3 3 ( 8 2 4 ) ，有淋巴结转移组阳性表达率显著高于无淋巴
12、结转移组( p - - O 0 0 9 ) ；C D l 4 7 在D u k e s 分期的A 、B 、c 、D 期中的表达率分别为2 7 3 ( 3 1 1 ) 、3 8 5 ( 5 1 3 ) 、7 2 75 ( 1 6 2 2 ) 和5 0 ( 1 2 ) ，各组I B 3 m 性表达率无统计学意义( p 0 0 5 ) 。A B 期的阳性表达率显著低于C - D 期的阳性表达率( p = 0 0 0 9 ) 。结论1 真核重组C D l 4 7 可以明显增强成纤维细胞M M P s 的表达，原核表达的C D l 4 7 没有M M P $ 刺激功能，可能与其缺乏糖基化有关。2 重组C
13、 D l 4 7 中的C 6 3 4 T ( L - F ) 的突变不影响C D l 4 7 的功能和定位，可能是潜在的一个S N P 位点。3 大肠癌细胞C D l 4 7 的与基质细胞或肿瘤细胞之间的M 啪P s 刺激作用是通过直接膜接触的方式进行的，而不是以分泌的形式或者“s h e do f f 的方式进行。4 C D l 4 7 在大肠癌中的表达与肿瘤的类型无关，与D u k e s 分期呈正相关。关键词大肠癌；C D l 4 7 ；基质金属蛋白酶( M P s ) ；基因克隆；基因表达；免疫组织化学6 C l o n i n g ，p u r i f i c a t i o na
14、n de x p r e s s i o no fh u m a nc d l 4 7a n di t ss t u d i e so nf u n c t i o nI n t r o d u c t i O i lC D l 4 7 E M M P R I N ，k n o w na se x t r a c e l l u l a rm a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s ei n d u c e r , i se x p r e s s e do nt u m o rc e l ls u r f a c e ，e s p e c i a l
15、 l yo u t s i d ei nv i v om a l i g n a n tt u m o rc e l ls u r f a c e C D l 4 7a l s op l a y sac r u c i a lr o l ei nt h en o r m a lc e l l s P r e v i o u sr e s e a r c h e si n d i c a t e dt h a tC D l 4 7i sat u m o rc e l l a s s o c i a t e df a c t o r , w h i c hi n v o l v e st h et
16、 u m o rg r o w t ha n dm e t a s t a s i s ，a n di sr e s p o m i b l ef o ri n d u c i n gp e d t t t m o rf i b r o b l a s t st op r o d u c e s e c r e t eM M P s T ou n d e r s t a n dt h es i g n a lt r a n s m i s s i o np a t h w a yb yw h i c hC D l 4 7s t i m u l a t et h ee x p r e s s i o no fM M P sh a v e b e e no n eo ft h eh o ts p o t s R e c e n t l y , t h eM M ：P s
