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1、独创性声明Y7 3 0 3 ( 7本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人以经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位敝储躲缮圈忙字嗍莎删螺歹月角学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密
2、的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者躲搠4 f签字蹶碱每6 只1 日一名：确，刈签字日期年b 月( 1 日第二军医大学硕士学位论文硕士学位论文研究生姓名学科及专业研究方向导师论文提交日期论文答辩日期学位授予日期王志刚免疫学免疫调节刊、卫民教授2 0 0 5 牟5 月2 0 0 5 年6 月2 0 0 5 年6 月上海第二军医大学2 0 0 2 年9 月一一2 0 0 5 年6 月本研究由国家自然科学基金面上项目资助：感染因子对D c 成熟的抑制效应及其信号转导机制( 3 0 2 7 1 2 3 2 )第二军医大学硕士学位论文L P S 刺激的小鼠骨髓来源树突状细胞生长和细胞周期分析中文
3、摘要树突状细胞( D C ) 是目前己知的功能最强的专职抗原提呈细胞。它们在体内广泛分布于血液、肝、脾、淋巴结以及其他非免疫组织器官中并有各自的名称：如淋巴器官中的并指状细胞，血液中的单核细胞和表皮中的郎罕氏细胞。D C 具有多种才i 同的形态、表型和功能。已知D C 的功能特点与其不成熟( i m m a t u r e ) 和成熟( m a t u r e ) 状态密切相关：总体上讲，不成熟的树突状细胞具有高效的抗原摄取、处理功能，呈非活化状态。因为表达共刺激分子和M H C 水平较低，不成熟树突状细胞对T 细胞的激活作用较弱。遇到感染信号后，不成熟树突状细胞摄取、处理外来抗原，经历一个分
4、化成熟过程并且迅速表达大量共刺激分子和稳定的M H C 而转变为成熟状态。此时树突状细胞的抗原提呈功能大大增强，而抗原摄取能力已大大降低，它们会迁移到淋巴器官刺激和活化初始T 细胞增殖。树突状细胞系统包括许多功能不同的亚群。按照表型和功能可以把小鼠树突状细胞的分为六个主要亚群：C D 8 。D C 、C D 8 + D C 、C D 8 i n t D C s 、朗罕氏细胞( L a n g e r h a n sc e l l s ) 、皮肤D C s ( D e r m a lD C s ) 和类浆细胞( B 2 2 0 * ) D C s 。每个亚群有不同的功能。例如，在体外F a s
5、诱导T 细胞凋亡时，C D 8 “ D C s 会引起C D 4 + T 细胞产生强烈的增殖反应，而C D 8 + D C s 诱导的反应相对较弱。B 2 2 0 + D C s 通过诱导调节性T 细胞的分化来介导T 细胞耐受。还有人报道不成熟D C 也可以通过诱导调节性T 细胞的分化间接引起T 细胞失能和耐受：而同一批不成熟D C ( i m D C ) ，接受了刺激信号后即分化成熟，从而启动效应性T 细胞的活化。由于树突状细胞在初次免疫应答中所扮演的重要角色，研究D C 在肿瘤免疫和免疫耐受中的调节作用有重大意义。D C 的不同成熟阶段和成熟过程是被精确而有效地调控着的。根据他们在微环境接
6、受的精确信号，D C 可以达到不同的活化状态以及不同的成熟状态从而发挥不同的功能。D C 的成熟可以由多种刺激物触发，包括接触性变态反应原，细菌和病毒，白细胞介素1 ( i n t e r l e u k i n 1 ，I L - 1 ) 、I I , - 6 、肿瘤坏死因子a ( T h F - a ) 等促炎症细胞因子，未甲基化C p G 、p o l y ( I ：C ) 等免疫刺激物，信号分子C D 4 0 L 等等。脂多糖( L i p o p o l y s a c c h a f i d e ，L P s ) 是革兰氏阴性细菌胞壁组分，是D c ( 包括3第二军医大学硕士学位论文
7、B 细胞和单核细胞) 成熟的强有力促进物，可提高他们的抗原递呈能力并促进炎症细胞因子的产生。虽然人们已经对D C 发育成熟、功能状态及其诱导和调控因素等进行了许多研究，我们以前的实验，通过细胞表型、形态学特征和功能研究也证明：L P S 短期刺激可诱导D C 成熟，而长期刺激则使得D C 处于不成熟状态；P K C B 可能参与调控D C 的成熟。但目前对D C 生长的详细细胞生物学特征( 特别是对其细胞周期) 及其分子机制的研究不多。由于细胞生长的细胞生物学特征及其分子机制与该细胞的发育、成熟、分化和发挥功能密切相关，所以我们在研究了L P S 和c p G 对小鼠骨髓来源的D C 发育成熟
8、和功能研究后，拟进一步研究D C 生长的细胞生物学特征及其分子机制。由于L P S 对D C 有多方面的影响，也是研究最成熟的、诱导D C 发育成熟的因子，我们选用L P S 作为刺激剂，旨在了解成熟D C ( L P S 短期刺激) 和不成熟D C ( L P S 长期刺激) 的生长状态和细胞周期有何不同，并进一步了解这种不同的分子机制。研究细胞生长的细胞生物学特征的方法有很多，例如用不同试剂抑制细胞生长于某个特定细胞周期，使细胞聚集在该细胞周期，撤除抑制剂后，细胞从该周期同时进入细胞周期的下一阶段，此方法称为同步化。同步化可得到处于同一细胞周期状态的大量细胞，有利于富集足够的细胞进行细胞生
9、物学研究。用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯( 5 ，6 - c a r b o x y f l u o r e s c e i nd i a c e t a t es u c c i n i m i d y le s t e r ，C F S E ) 着染细胞，细胞每分裂一代，其含量就降低一半，利用这个特性可研究细胞在一定时间内分裂的次数；用【3 H 】T U R 或B U d R 掺入细胞，在细胞生长一定时间后，根据细胞数判定细胞的传代次数等。目前有很多种鉴别基因表达差异的技术。这些技术为细胞生物学家研究细胞的生命过程提供了一个重要的工具，比如：核酸印迹杂交( N o n h e r ab
10、l o t t i n g ) 、R T o p C R 、差异显示法( D i f f e r e n t i a ld i s p l a y ) 和R N A 酶保护试验( R N A s ep r o t e c t i o na s s a v s l 等。但是，D N A 基因芯片技术却可以在一个样品中同时快速检测成百上千的基因表达差异。这些D N A 微列阵研究的优点是，可以根据生物功能的相关性来精心挑选基因，这样所有基因的变化就一目了然。基因芯片方法使同时分析多个基因表达的情况成为可能。许多细胞生物学的过程是在m R N A 水平上调控的。基因表达方式的系统研究已经被证明了在研
11、究L P S 等天然刺激物对细胞产4第二军医大学硕士学位论文生的作用方面具有极高的实用价值，同时也是鉴定细胞内特定的生命功能活动的分子表达和关键途径的强有力的工具。众所周知，L P S 对树状细胞有多方面的影响。但是，树突状细胞的分化和成熟的分子生物学机制、特别是在基因芯片的基础上对L P S 刺激的树突状细胞的生K 发育和细胞周期的影响进行全方位的研究还很不足。人的单核细胞来源的树突状细胞f M o D c s ) 基因表达情况已经通过基因表达序列分析( S e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n ，S A G E ) 或D
12、 N A 微列阵分析确定过，也有与此类似的小鼠骨髓细胞来源的成熟( m D c ) 与不成熟树突状细胞( i m D c ) 相关的对比。但是用基因芯片研究在L P S 长期刺激下，小鼠B M D C 的生长以及功能变化却未见报告。在本研究中J & f f 使用基因芯片系统地为L P S 长期刺激和短期刺激咀及无刺激小鼠B M D C 的细胞周期基因表达情况进行了比较详细的对比。我们用本教研室传统的方法来培养小鼠骨髓细胞来源的树突状细胞。众所周知，C D 3 4 + 骨髓细胞在G M C S F 作用下可以成为树突状细胞。实验分3 组：1 L P S 持续刺激组用来研究L P S 持续存在对树
13、突状细胞成熟的影响。2 ，不加L P S 组作为空白对照组3 L P S 单次刺激组，即在培养的最后两天加入L P S ，诱导D C 成熟。经过7 天的培养期，树突状细胞被收集起来做如下实验：C F S E 染色，M T T 树突状细胞同步化，D N A 微列阵分析和a f f y m e t r i x 基因芯片分析。结果如下：一、用M q T 法检测各组培养第3 天到第1 0 天时，D C 数量的变化从对照组可见，从第三天到第五天，测定的O D 值逐步上升，细胞计数也是同步变化，逐步增多。然而随着时间的推移，从第六天到第八天，O D 值处于稳定状态，似乎还有所下降，细胞数目也已经不再增长，
14、此时表示生长速度和死亡速度几乎均等。L P S 长期刺激组长势缓慢，曲线平缓上升而后略为有所下降。短期刺激组前几天基本上与对照组相似，但是在成熟后则出现较大的下降坡度。二：、用C F S E 着染D C ，经不同处理后用流式细胞仪检测，了解D C 的增殖。C F S E 是一种荧光染料，其被摄入细胞后，细胞每分裂一代，其含量就降低一半。我们可以利用这个特性研究D C 在一定时间内分裂的次数。通过实验我们发现，在流式分析中，对照组图形逐渐向左偏移，出现明显的三个峰，说明不成熟D C 是增殖的。长期组也出现了三个峰，但是分裂不明显。短期组只有两个。5第二军医大学硕士学位论文可能在加入L P S 后
15、，其很快成熟然后停止分裂。这与后面的芯片结果分析是一致的。三、将D c 进行同步化培养在此试验中，我们试图将细胞同步化，期望收集更多的同时相的细胞，以进行更多的实验。将细胞进行同步化的文献在网上很多，但我们在网上没有查到同步化D c 的文献。所以我们只能参考同步化其他细胞的文献，使用胸腺核苷( T h y m i d i n e ) 、氨甲喋呤( M e t h o t r e x a t e ) 、含羞草氨酸( L - M i m o s i n e ) 、诺考达唑( N o c o d a z o l e ) 、羟基脲( H y d r o x y u r e a ) 、阿菲迪霉素( A
16、p h i d i c o l i n ) 及这几种试剂的组合来尝试将其同步化，因为这几种试剂被绝大多数文献使用。结果显示，使用含羞草氨酸、诺考达唑、阿菲迪霉素可以达到一定的同步化效果，但是不能够完全同步化。四、用基因芯片全面比较不同处理组D c 之间的基因变化。众所周知，在D c 培养的后期加入L P S 等刺激物会诱导其成熟。但是我们的目的在于从培养的初期就加入L P S 研究其是否与后期加入产生同样的效果。于是我们用C L O N T E C H 公司的A t l a sm o u s ec D N Ae x p r e s sa r r a y 及其所附送的软件对不同处理组之间的D c 基因表达情况进行了分析。由于其基因数日有限，未能达到预期目的。所以我们又用A f f y m e t r i x 基因表达芯片进一步分析和比较不同处理后D c 基因表达情况。试验结果发现，长V S 短，短V S 对和长V S 对分别有3 0 2 5 ( 1 3 3 ) 、9 3 9 ( 4 1 ) 、2 0 6 8 ( 9 1 1 条基因改变，差别还是
