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1、编号：四川农业大学本科毕业论文（设计） （2014 届）题 目： 齐口裂腹鱼 GtH-R基因的克隆及其序列分析院 别： 动物科技学院水产系 专 业： 水产养殖教育 姓 名： 刘永贵 指导教师： 完成日期： 2013 年 12 月 14 日齐口裂腹鱼 GtH-R基因的克隆及其序列分析动物科技学院 水产养殖教育 刘永贵 指导老师：姜冬梅 实验师摘要：摘要：【目的】通过对齐口裂腹鱼垂体组织中GtH-R基因的克隆及测序，研究齐口裂腹鱼促性腺激素受体基因的序列特征及功能特性。 【方法】将提取的总RNA进行反转录PCR扩增，并用回收的扩增产物来完成克隆及测序。 【结果】本试验获得的齐口腹裂鱼GtH-R目的
2、片段长度为696 bp，其核酸序列与斑马鱼的相似性达93%，而氨基酸序列相较于斑马鱼，相似性也高达97%；通过蛋白质的序列分析发现：GtH-R蛋白质中螺旋结构占61.43%；折叠结构占15.24%；无规则卷曲结构占23.33%。 【讨论】试验得出齐口裂腹鱼GtH-R基因的保守性高，为进一步研究齐口裂腹鱼的繁殖调控机制提供了一些基础数据。关键词：关键词：齐口裂腹鱼；促性腺激素；促性腺激素受体；序列分析Cloning and sequence analysis GtH-Rgene in the Schizothorax prenantiAnimal science and technology o
3、f college Aquaculture education Liu YongGuiGuidance teachers: Jiang DongMei Experimental teachersAbstract: Objective By cloning and sequence analysis GtH-R gene of Schizothorax prenanti pituitary tissue , study of Schizothorax prenanti gonadotropin hormone receptorgene sequence features and function
4、al properties. Method The total RNA was extracted and amplified by reverse transcription PCR, the amplified product recovery to complete for cloning and sequencing. Results Schizothorax prenanti GtH-R objective fragment length obtained in this experiment is 696 bp, the nucleic acid sequence similari
5、ty with Danio rerio as 93%, while the amino acid sequence compared to Danio rerio, similarity is as high as 97%; protein sequence analysis showed: 61.43% alpha helix structure of GtH-R II protein; beta folding structure for 15.24%; random coil structure accounted for 23.33%. Conclusion The results s
6、how Schizothorax prenanti GtH-Rgene conservative high, also provides some basic data for further study of Schizothorax prenanti reproductive regulation mechanism.Key words: Schizothorax prenanti; gonadotropin hormone; gonadotropin hormone receptor ; sequence analysis早期研究认为，鱼类中只有一种类似LH的促性腺激素，直到20世纪70
7、年代中期，加拿大学者Idferlz等人在改进促性腺激素(Gonadotropin Hormone,GtH)的纯化技术后，从鲤鱼、大麻哈鱼等鱼的脑垂体中发现了两种不同类型的GtH，即GtH和GtH，功能研究表明，GtH和GtH分别对应于哺乳动物的FSH和LH1；而到1999年Yuichi Oba等用纯化的GtH和GtH证明大麻哈鱼的性腺存在着两种类型的GtH受体（Gonadotropin Hormone Receptor, GtH-R） ，分别称为GtH-R和GtH-R2,3，随后的研究进一步证实了鱼类GtH-R的二元性，结构和功能分析显示，它们分别对应于哺乳动物的促卵泡激素受体（FSH-R）和
8、促黄体素受体（LH-R）4-8。LH在鱼类称为促性腺激素(Gonadotropin Hormone, GtH)，它的主要功能是促进卵母细胞的成熟、排卵和卵巢类固醇激素的合成；参与调控精巢中类固醇激素的生成及间质细胞的分化，在精子发生的最后几个时期起主要作用9-11。对其它鱼的研究表明，GtH在体内的重要生理功能由促性腺激素受体(Gonadotropin Hormone Receptor ,GtH-R)介导，性腺中GtH主要在排卵前期滤泡的膜细胞层和颗粒细胞层以及精巢的间质细胞中表达12-14。目前，编码FSH和LH这两种受体的基因已经从一些硬骨鱼类的性腺中得到克隆，例如罗非鱼（Oreochro
9、mis niloticus） 、斑点叉尾鮰（Letulurus pinctatus） 、非洲鲶鱼（Clarias gariepinus） 、斑马鱼（Danio rerio） 、日本鳗鲡（Anguilla japonica） 、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）和鳙鱼（Hypophthalmichthys nobilis）等15。令人感兴趣的是，鱼类中GtH基因除了在性腺中有丰富的表达外，在非性腺组织中也有少量或微量表达3,16；但迄今为止还尚未见有对齐口裂腹鱼GtH-R基因的克隆及序列研究，因此，本试验通过对齐口裂腹鱼GtH-R基因的克隆及序列分析，阐明促性腺激素受体在齐
10、口裂腹鱼生殖周期的生理作用, 以期为阐明齐口裂腹鱼繁殖调控机制提供科学依据。1 材料与方法材料与方法1.1 试验材料试验材料选取的齐口裂腹鱼平均体长为3040cm； 平均体重为0.51.0kg。采集齐口裂腹鱼垂体样品，置于液氮中速冻，然后转移至-80超低温冰箱中保存备用。1.2 试剂和仪器试剂和仪器DNA回收试剂盒、pMD18-T载体、DL2000 bp DNA Marker，反转录酶和Taq酶购自宝生物公司；-80低温冰箱(Thermo)、PCR仪(Bio-Rad)、高速冷冻离心机(Thermo)、凝胶成像系统(Bio-Rad)、DYY-III-68型稳压流电泳仪、紫外分光光度计(Shima
11、dzu)。Typtone、Yeast Extract、NaCK琼脂糖、琼脂粉、氨节青霉素、IPTG、X-Gal、DEPC及其他生物试剂均为进口或国产分析纯试剂。本实验引物由华大基因有限公司合成。1.3 总总RNA的提取的提取用 Trizol 法按照试剂盒说明书的步骤提取总 RNA，本实验所用离心管、枪头和水均经 0.1 %焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）过夜处理，高压灭菌后烘干处理。用 DEPC 处理水配置溶液。提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解组织，本实验提取RNA 的过程要求快速准确，避免总 RNA 的过度降解，试验操作过程中要保证无菌，带上口罩，手套
12、确保 RNA 不被核酸酶降解。1.4 引物设计与合成引物设计与合成根据NCBI上斑马鱼GtH-R的cDNA序列，选取保守区序列，运用Premier 5.0 软件设计引物。GtH-R基因上游引物为5CATCCGTCGAGGACACTTTCGGTA3，下游引物为5ACACATAGCATCCGCAAATCACGAG3，PCR产物长度为696 bp。委托华大基因科技有限公司进行特异性引物合成。1.5 反转录反应反转录反应反转录按 Invitrogen 公司的反转录试剂盒要求进行，得到的 cDNA 置于-20 冰箱中保存备用或直接用于 PCR 扩增；此次采用 Invitrogen 公司生产的 MMLV
13、进行反转录反应。1.6 PCR扩增目的基因片段扩增目的基因片段以 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。电泳检测扩增产物，根据检测结果对扩增条件作进一步调整，以获得最佳的目的片段。最终确认 PCR 产物后，将扩增效果最好的样品产物用于胶回收。1.7 PCR产物回收及克隆测序产物回收及克隆测序用Omega凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，将稀释的DNA保存在-20冰箱中备用。将PCR回收产物导入到pMD18-T载体中，将其转入大肠杆菌中进行复制，经酶切、PCR鉴定，然后将克隆的产物送华大基因公司测序。1.8 序列分析序列分析测序产物经 NCBI 网站上的 VecScreen 软件修剪载体序列，获
14、得 GtH-R基因编码区序列，应用 Blast 软件进行相似性比对。利用 BioEdit 软件进行蛋白质组成、疏水性以及抗原决定簇等相关分析；利用 HNN 在线软件分析预测氨基酸的二级结构；应用 NetPhos2.0分析预测蛋白质的磷酸化位点。2 结果与分析结果与分析2.1 总总 RNA 提取提取以齐口裂腹鱼垂体组织提取齐口裂腹鱼垂体组织基因组总 RNA 采用常规酚-氯仿抽提法，1%琼脂糖凝胶下电泳抽提产物，并于紫外透射仪上进行观察，然后在凝胶成像系统上进行扫描，从图 1 可见齐口裂腹鱼垂体组织基因组总 DNA 条带明亮、整齐无拖带。其中 28S RNA 和 18S RNA 的条带亮度比值约为
15、 l2:1，表明 28S 的条带比 18S 的条带亮度高，总 RNA 降解较少；抽提基因组 RNA 的纯度和浓度均满足 PCR 扩增要求。图 1 齐口裂腹鱼垂体组织总 RNA 1%琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 1 Total RNA 1% agarose gel electrophoresis of Schizothorax prenanti pituitary tissue2.2 RT-PCR 产物检测产物检测图2 齐口裂腹鱼GtH-R基因PCR电泳检测图Marker: DL2000 GtH-R基因引物 PCR 扩增产物 Fig. 2 Electrophoresis pattern of Sc
16、hizothorax prenanti GtH-Rgene Marker: DL2000 GtH-Rgene primer PCR products经1%琼脂糖凝胶电泳检测GtH-R基因引物PCR扩增结果，之后采用凝胶成像系统扫描结果可见图2，显示目的扩增片段长度为696 bp，与引物设计的产物大小一致并且特异性较好；可以满足后续实验的要求。2.3 GtH-R核酸序列比对核酸序列比对图 3 齐口裂腹鱼 GtH-R基因 cDNA 部分编码序列及序列分析Fig. 3 The coding sequence analysis of Schizothorax prenanti GtH-Ra part cDNA应用生物信息学软件 Lasergene 对 GtH-R基因编码核酸序列的
