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1、W nt信号通路在乳腺癌中的作用何艳姣, 刘朝霞, 乔 超, 徐妙生, 俞 进, 李 光 (首都医科大学附属北京天坛医院病理科, 北京 100050)摘要: 目的 探讨乳腺癌中 W nt信号通路关键因子 B2catenin的突变和表达及靶基因 cyclinD1 、c 2myc的表达及意义。 方法 应用免疫组化 SP法检测 119例乳腺癌, 72例乳腺增生症和 40例正常乳腺组织中 B2catenin 、cyclinD1 、c2myc的表达, 并分析其与乳腺癌临床病理特征的关系。应用 PCR和基因测序的方法检测 44例乳腺癌 B2catenin外显子 3的突变情况, 同时应用免疫组化 SP法检测
2、其 B2catenin的表达。 结果 40例正常乳腺组织中 B2catenin在细胞膜中强表达, cyclinD1及 c2myc阴性表达。乳腺癌 B2catenin异常表达率明显高于乳腺增生症, 组间比较差异有显著性 ( 78. 15 % vs 44. 44%, P 70 %细胞阳性为正 常表达, 反之为表达缺失; 细胞质或细胞核 10 % 细胞阳性为胞质或胞核阳性表达, 胞质或胞核表达为异位表达。异位表达和表达缺失统归为异常表达。 cyclinD1阳性为棕黄色颗粒状染色, 表达于细胞核, c2 myc阳性为棕黄色颗粒状染色, 可表达于细胞核和细胞质, 随机选取 10个高倍视野, 每个视野计数
3、 100个瘤细胞, 计数阳性细胞百分比, 10 %为过度表达。1 . 4 B2catenin基因外显子 3突变的检测 用常规 酚 - 氯仿法提取 DNA。用提取的 DNA 作模板进行PCR扩增, PCR 引物: 上游 5c- GCTGATTTGATG2GAGTTGGA- 3c , 下游 5c- GCTACTTGTTCTTGAGT2GAA- 3c 。 PCR扩增: 反应体系为 30 L,l 反应条件: 94 e预变性 5min , 94 e 变性 40 s , 54 e 退火 40 s , 72 e延伸 60 s , 35个循环后于 72 e 延伸 10min , 产物长度为 227 bp 。
4、DNA扩增后, 用 1 . 5 % 琼脂糖凝胶电泳检测得一条清晰的条带。PCR产物纯化按照 Millipore公司 96纯化板操作流程操作, PCR产物测序由北京华大基因 有限公司提供, 用 BLAST软件分析测序结果。1 . 5 统计学分析 采用 SPSS forW indo ws 11 . 0统计分析软件进行分析, 用卡方检验和确切概率法。2 结果 2 . 1 B2catenin , cyclin D1 , c2 myc表达 乳腺癌、 乳腺增生症及正常乳腺组织中 B2catenin 、cyclinD1 、c2 myc 的表达情况见图 1- 4(见第 284页 )。乳腺癌中 B2cateni
5、n的异常表达率为 78 . 15 %( 93/119), cyclinD1的阳性表达率为 57 . 98% ( 69/119), c2 myc的阳性表达率为 56 . 30 % ( 67/119)。乳腺增生症中 B2catenin的异常表达率为 44 . 44 % ( 32/72), cyclinD1的阳性表达率为 33 . 33 % ( 24/72), c2 myc的阳性表达率为 27 . 78 % ( 20/72)。 40例正常乳腺组织中 B2catenin在细胞膜中强表达, 而 cyclinD1及 c2 myc阴性表达。乳腺癌 B2catenin异常表达率明显高于乳腺增生症 (P 50岁
6、6955( 79. 71)41( 59. 42)35(50. 72) 病变部位0 . 5560. 8150. 809左6149( 80. 32)36( 59. 02)35(57. 38)右5844( 75. 86)33( 56. 90)32(55. 17) 病变大小0 . 8510. 7850. 041 2 cm6652( 78. 79)39( 59. 09)32(48. 48) 2 cm5341( 77. 36)30( 56. 60)35(66. 04) 组织学类型0 . 4190. 9890. 342浸润性导管癌8165( 80. 25)47( 58. 02)48(59. 26)其他382
7、8( 73. 68)22( 57. 89)19(50. 00) 淋巴结转移0 . 0310. 0030. 041有2826( 92. 86)23( 82. 14)23(82. 14)无9167( 73. 63)46( 50. 55)44(48. 35)表 2 乳腺癌中 B2catenin的异常表达与 cyclinD1、c2myc的表达相关性Tab 2 The relationship between expression of B2cateninand cyclinD1 , c2myc in breast cancerB2catenincyclinD1 +-Pc 2myc +-P 异常表达60
8、330. 00653400 . 775 正常表达91714123 讨论 经典 Wnt信号转导通路致癌的关键是该途径任何一个信号分子异常致 B2catenin在细胞质 /核内累积。 B2catenin是一种多功能细胞质内的可溶性蛋白, 由于它在细胞黏附和增殖过程中的双重作用, 已成为肿瘤发生发展机制研究中的热点。近来研究表明, B2catenin在细胞质和核内的累积是恶性肿瘤 中的常见事件之一, 在结直肠腺瘤和癌4等多种肿瘤中均发现 B2catenin异常表达并与肿瘤发生相关,但在乳腺癌中的报道结果不一致。 Bankfalvi等 5发现从乳腺正常组织到浸润癌的发展过程中 B2catenin膜表达
9、下调, 认为 B2catenin的改变是乳腺癌发生过程中的早期事件。Lin等6、 Li m等7、 Lop2ez2 Kno wles等8报道了乳腺癌中 B2catenin的异常表达与预后不良有关, 可以作为乳腺癌的独立预后因子。而 Chung等9研究表明 B2catenin异常表达 与预后无关, 只有同时存在 B2catenin异常表达和p53高表达时才与预后不良有关, 因此, B2catenin不能作为乳腺癌的独立预后因子。王珂等 10研究表明 B2catenin异常表达与 H er2阳性表达有关, 二者异常表达协同促进乳腺癌细胞的淋巴结转移。本研究发现乳腺癌 B2catenin异常表达率明显
10、高于乳腺 增生症, 组间比较差异有显著性, 表明 B2catenin异常表达在乳腺癌发生发展过程中起重要作用。同时 发现 B2catenin的异常表达与淋巴结转移相关, 表明其可以作为乳腺癌的独立预后因子。CyclinD1和 c2 myc作为原癌基因, 参与细胞的 增殖、 分化与凋亡, 并且与多种肿瘤发生发展有关。近来研究显示, cyclinD1 、 c2 myc是 Wnt信号转导通 路非常重要的靶基因, 免疫组化研究证实在多种肿瘤中 cyclinD1、 c2 myc过表达与 B2catenin异常表达和 Wnt突变有关。在乳腺癌中, 有报道显示 cy2 clinD1 、 c2 myc在乳腺癌
11、发生中起重要作用, 但仅有少数研究报道了 B2catenin异常表达与 cyclinD1 、c2 myc过表达的相关性研究, 且意见不一致。Ozaki等11研究显示 B2catenin异常表达与 cyclinD1 、c2myc过表达有关; Roh等12研究显示 B2catenin异常表达可上调 c2 myc表达; Lin等 6证实 B2catenin异常表达与 cyclin D1高表达相关; Li m等 7研究显示B2catenin异常表达与 cyclinD1过表达无关。本研究显示 cyclinD1 、c2 myc的过表达与淋巴结转移相 关, 表明它们也可以作为评价乳腺癌转移、 预后的重要因子
12、。同时 B2catenin异常表达与 cyclin D1过表 达相关, 而与 c2 myc过表达无关, 表明 B2catenin在乳腺癌发生过程中其作用可能是通过上调 cyclinD1的表达, 导致细胞外基质降解和细胞增殖分化失控#212# 山西医科大学学报( J ShanxiMedUniv)2010年 3月,41 ( 3) 而实现的。细胞内 B2catenin异常积聚可由 B2catenin基因 突变所致, 在许多实体肿瘤中均可检测到 B2catenin基因突变13, 14。 B2catenin基因定位于染色体 3p21,全长 23 . 2 kb, 共有 16个外显子, 其中第 3外显子区含
13、有编码丝氨酸和苏氨酸位点的相关序列, 其上第 33, 37 , 41, 45位密码子是糖原合成酶激酶 - 3B( gly2cogen synthase kinase , GSK2 3B)的磷酸化位点, 因此B2catenin基因突变通常发生于第 3外显子。Zhuang等 15在 13例 1 , 3- 丁二烯诱导的 B6C3F1鼠乳腺癌中发现 3例存在 B2catenin基因突变, 分别在密码子 33 , 34 , 41 。但也有文献报道, 在乳腺癌中没有检测到 B2catenin的基因突变16 , 17, 相反在乳腺纤维腺瘤中检测到 45%病例有 B2catenin基因突变18。本研究未检测到
14、乳腺癌组织中 B2catenin基因外显子 3的突变, 与 K izildag等16、 刘臻等 17研究结果相符,提示乳腺癌组织中细胞内 B2catenin异常积聚不是 由 B2catenin基因突变所致, 可能存在其他途径调节B2catenin的表达, 如 B2catenin降解复合物 (包括APC、 GSK2 3B及 Axin)异常, B2catenin基因扩增19,W nt信号通路上游组分 (包括 Wnt基因、 Frizzled受体及 Dishevelled蛋白等 )的调节, 介导细胞黏附作用的上皮钙黏素 - 连环素复合体 ( E2cadherin/cate2nin)中 E2cadher
15、in裂解后可使 B2catenin在细胞质内 异常集聚20等。以上这些有待于进一步的研究证实。参考文献:1 Miller JR. The Wnts J. Geno me Bio,l 2002 , 3( 1): 3001 -3015 .2 Polakis P. W nt signaling and cancer J. Genes Dev , 2000 , 14( 15): 1837- 1851.3 Maruyama K, OchiaiA, Aki moto S , et al. Cytoplas m ic beta2cate2nin as a predictor ofhematogenousme
16、tastasis in human colorectalcancer J. Oncoloby , 2000 , 59(4): 302- 309 .4 Bienz M, Clevers H. Linking colorectal cancer toWnt signaling J. Cel, l 2000, 103(2): 311- 320.5 BankfalviA, Terpe HJ , Breukel mann D, et a l . I mmunophenotypicand prognostic analysis ofE2cadherin and beta2catenin expressionduring breast carcinogenesis and tumour progression: a compara2tive studywith CD44 J. H istopathology , 1999 , 34(1):
