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1、研究报告气相和高效液相色谱法测定油菜籽（ 饼） 中的硫代葡萄糖甙*吴谋成熊时中 袁俊华周永明 牟同敏（ 华中农业大学中 心实验室，武汉） 提要 本文报道气相色 谱和高效液相色 谱法测定油菜籽（ 饼） 中 硫代葡萄 糖甙的样品 预处理技术和测试技术。气相色谱法采用氢焰离子化检测器，3 m m1 . 6 m玻璃柱， 2 O V- 1 或 2 O V - 7 固 定液， C h r o m o s o r b W A W D MC S 担 体 （ 6 0 8 0 目 ） 。高效液相色 谱采用 4 m m 2 5 0 m m 不锈钢柱， 柱内 填充Y WG - C 1 8 H3 7 ( 1 0m 2
2、) 。流 动相 为 3 乙 腈， U V - 2 2 0 n m 检 测。 G C 和H P L C 测 定结 果一致。 与经典重量 法对照， 总量绝对误差小于 1 .1 2m o l/。 气相和 液相 色谱重复性 试验， 总量的 标准 偏差分别 为0 .1 0 和0 .6 7 。首 次指出 我国 油菜 含有吲胚 哚 类硫 代葡萄糖甙和大致含量。油莱是我国的主要油料作物。油菜籽 （ 饼）中含有硫代 葡萄糖甙 （ G l u c o s i n o l a - t e s ， 以下简称硫甙），它在内源芥子酶的作 用下，水解成恶唑烷硫酮、异硫氰酸盐、腈 等有毒物质，影响了油菜饼的品质。国内外育种工
3、作者正致力于培育低硫甙 品种，以提 高油菜籽 （ 饼）的食用及饲用质量。因此， 硫甙的测试技术是国内外的重要研究课题。 我国已将其列入 “七 五”国家重点攻关项 目。硫甙的测定，分为总量和各 组 分 的 测 定。我们曾提出过作为育种学家筛选育种材 料的总量测定方法 1 ,2 。 但是，深入的研究 要求我们对硫甙各组分进行准确的测定。硫甙各组分的测定，Th i e s 3 ,4 提 出用 离子交换树脂将样品中硫甙进行富集、分 离，用硫酸酯酶脱掉硫甙中的硫酸根，制备 T MS 衍 生物，用气相色谱测定 （ 简称T M S 法），使 T MS法成为各国通用的分析方 法 3 - 5 。 但是T MS
4、法不能测定易于热 解的硫甙， 如吲哚类硫甙。据R o g e r ( 1 9 8 2 ) 报道， 在 甘蓝型油菜中， 吲哚类硫甙约含1 4m o l / g ， 油菜品 质育种 仍不能忽视。 此外， 在1 9 8 3 年巴 黎国际油菜分析化学会议上，B . U p p s t m指出 ，T MS 法 重现性差， 对同 一样品测定 结果差异颇大。因此，许多学者正致力于 H P L C 的研究 6 - 1 3 。 本文着重讨论样品制备技术，T MS法 重现性差的原因，G C 和HP L C 的色谱条件。 在仅有烯丙基硫甙的情况下，对各峰进行定 性和修订定量校正因子。研究了我国甘蓝 型、白菜型、芥菜
5、型油菜的主 要 硫甙组成， 特别是国内尚未研究过的吲 胚 哚 类硫甙的种类 和含量范围。兹将研究结果报道如下。实验方法（ 一）试剂 D E AE - S e p h a d e x A- 2 5 ， P h a r m a c i a 进口分装；烯丙基硫甙，A l d r i c h C h e m i c a l C o m p a n y , U S A ; B S T F A , E . Me r c k . 冰 乙酸、醋酸铅、醋酸钡、乙腈、 T MC S 、 吡啶均为AR ，上海试剂一厂出品。 （ 二）色谱分析条件 气相色谱采用氢焰离子化检测器；3 m m 1 . 6 m玻璃柱，2 O
6、 V - 1 或2 O V - 7 固定 液，C h r o m o s o r b W A W DMC S 担体 （ 6 0本文摘要曾在第 六次 全国色 谱学术 报告 会宣读过，-8 0 目）；程序升温：初始温度1 9 0 ， 终止 温度2 8 0 ， 升温速率3 / mi n ； 进样口 谖 温度： 3 0 0 ； 载气流速：N 2 3 0 m l / m i n ， H 2 5 0 m l / m i n ，空气5 0 0 m l / mi n 。高效液相色谱采用 紫外检测器，检测波长 2 2 0 n m ； 4 m m 2 5 0 mm 不锈钢柱，柱内填 畛 充 Y WG- C 1 8
7、 H3 7 ( 1 0m 2 ) ； 流 动相 为 3 乙 腈， 流速 2 .5 m l / mi n 。 （ 三）材料及样品的预处理和测定 1 . D E AE - S e p h a d e x A- 2 5柱的制 备： 将 5 g D EA E - S e p h a d e x A- 2 5 置于 2 5 0 m l 烧杯中，加入5 0 m 1 水，浸泡2 4 小时以 上备用。用玻璃纤维塞入8 1 5 0 mm 层析柱 的底部，加入少量水于柱中，用滴管吸入少 量 浸泡好了的D E A E - S e p h a d e x A - 2 5 ，沿 柱壁注入柱内，制成一个高约1mm的层析
8、柱 （ 相当于1 0 0 m g ），待水面快要接近柱面 时，盖上塞子，以防水全部流干。 2 样品制备：准确称取脱脂样 品 0 2 0 0 g 于1 0 m 1 离心管中 ， 加沸水4 m l ， 在沸水 浴中提取5 分钟。 冷后加入内标烯丙基硫甙标 准溶液1 m1 ( 1 . 5 m o 1 / m l ) ， 摇匀。加0 . 5 ml 浓 度为0 .5 m o 1 / L 的B a ( Ac ) 2 P b ( Ac ) 2 溶液， 水浴上温热，稍冷后离心5分钟 （ 3 0 0 0 r / mi n ）。吸 取 上 清 液2 . 5 m1 放 入 DE A E- S e p h a d e
9、 x A - 2 5 层析柱中，当柱子流干后， 用 2 5 m 1 0 .0 2 m o l / L 醋酸吡啶溶液洗 涤一次， 再用2 4 m l 水洗二次。加入l ml 0 .2 硫 酸 酯酶 （ H - 1 型），待近干时，塞紧 塞子， 放置过夜。每次用1 ml 水，连续淋洗色谱柱 4次。将淋洗液合并，摇匀后供测定用。 3 . 液相色谱测定和结果的计算：取1 0 2 0l 制备液按液相色谱条件进样分析。按 下式计算硫甙含量。表 1 校正系数表如样品中含有内标硫甙，采用内加标准 法，对内标峰面积作校正，操作如下： 称取重量相同的同一样品两份，一份加 入内标，另一份不加内标。在同一条件下测 定
10、，按下式求出样品中原有的烯丙基硫甙的峰面积。*某一硫甙指峰面积最大的硫甙 故： 内标峰 面积= 丙烯基硫甙 面积一 样品中 原有烯丙基硫甙峰 面积。4 气相色谱测定和结果的计算：取 2 m l 制备液在8 0 水浴锅中，用旋转蒸发器 蒸干或放在衍生管中，在1 0 0 以 下放有干 燥硅胶的烘箱中烘干。加入吡啶 1 0 0 l， B S T F A 1 0 01 ，T MC S 1 01 。塞紧瓶塞， 振动摇匀。在1 2 0 保温2 0 分钟，制备衍生 物。取1l 按气相色谱条件进样分析。计算结果 。表 2 内标和相应的硫甙T M S 碳原子数的比值如样品 含有内标， 与L C 一样进行校。结
11、果 与 讨 论表3和图1 3 是此法测得的结果。图中 各峰的编号与表1 编号相对应。气相和液相 的测定结果一致。液相总量和重量法 2 比 较，绝对误差少于 1 . 1 2m o l / g 。相对误差少于4 . 0 4 。对同一样品进行五回三次重复 性精密度（ r e p e a t a b i l i t y p r e c i s i o n ） 试验， 气相和液相总量的标准偏差分别为0 .1 0 和 0 .6 7 。用本法曾对全国各地送来的一千多份 油菜籽（ 饼） 和猪肉、鸡肉、内脏、鸡蛋的残留量富集后进行了测定，获得满意结果。表 3 结果对照表样品的预处理，文献报道 3 - 6 较复杂
12、。 我们进行了简化。并着重指出，对脱硫酸根 后的硫甙用等量凝胶体积的水淋洗 3 - 1 4 ，未能将全部硫甙洗脱，必须用四倍于凝胶体 积的水才能将全部硫甙洗脱。这也许是原 TMS 法重现性差的主要原因。原 T MS法用氦气作载气，改用氮气， 结果一致，容易推广普及。国外HP L C测定 均采用梯度淋洗技术。考虑到乙腈的纯度和 在检测波长下有吸收，我们采用3乙腈等 速淋洗。乙腈用量从2 8 ，各峰均可分 离完全。检测波长选择在2 2 0 n m，有利于含 量较低的4 烯基硫甙的测定。 气相色谱中各峰的定性和定量因子，文 献已有详细研究 3 - 6 。由于目前国内外尚没 有齐备的硫甙标准物，给液相
13、色谱各峰的定 性和定量带来了困难。考虑到样品经用弱阴 离子交换柱分离杂质，用硫酸酯酶脱硫酸根 的处理，必然得到较纯的硫甙的特点，首先 根据色谱的保留行为和内标物的位置作初步 的预测。然后用文献的方法 9 , 1 2 , 1 3 ，将吲哚 类和非吲 胚 哚硫甙分开，将各峰的滤液收集、 浓缩，得到一系列吲崂类和非吲 胚 哚类硫甙的 紫外和红外谱图以进一步确定。难以确定的 再用质谱定性。校正因子的确定，采用气相 色谱结果、重量法结果进行修定。为了证实吲哚类硫甙不适宜于用气相色 谱测定，我们将液相色谱得到的吲胚哚 崂类硫甙 按气相色谱法测定，在O V - 7 柱上不出峰， 与文献 9 的论述相符。在O
14、 V - 1柱上出现峰 形 （ 图3 ，9 号峰），但出峰的规律性难以 掌握，峰面积时大时小，无法定量。 利用液相色谱法， 研究了 我国 油菜的主 要硫甙组成。并涉足于我国尚未研究过的吲 哚类硫甙。在甘蓝型油菜中，吲哚类硫甙主 要以4 - 羟基- 3 - 甲基吲崃硫甙为主，其次为 3 - 甲基吲哚硫甙。低硫甙品种含量在2 1 0 m o l / g ，约 占全硫甙量的5 0 左右。高硫 甙品种可达 1 5mo l / g 。芥菜型和白菜型油 菜吲 胚 哚 崂 类硫甙主要为3 - 甲基吲 胚哚 崃 硫甙和4 - 甲 基- 3 - 甲基吲哚硫甙，含量在2 8m o l / g 。 以往，我国的育种
15、工作者重视非吲哚硫甙， 忽视吲哚类硫甙，虽然在高硫甙品种中，不会引起太大问题。但在培育低硫甙的优质油 菜品种时，必须引起足够的重视。参考 文献1吴谋 成，华中农 业大学 学报，( 3 ) , 1( 1 9 8 3 ) . 2吴 谋成，中 国油料，( 4 ) , 6 7 ( 1 9 8 5 ) . 3W T h i e sF e t t eS e i f e n A n s t r i c h m .7 82 3 1 ( 1 9 7 6 ) . 4W T h i e s ZP f l a n z e n z 砪 c h t g . , 7 93 3 1 ( 1 9 7 7 ) . 5D I Mc
16、 G r e g o r WJ M u l l i n G R . F e n w i c k J A s s o c O f f An a l C h e m.6 6 , 8 2 5( 1 9 8 3 ) . 6PH e l b o eO O l s e n e t a l . JC h r o m a t o g r . , 1 9 7 1 9 9( 1 9 8 0 ) . 7IMi n c h i n t o n JS a n gD B u r k eR J W. T r u s c o t tJC h r o m a t o g r . 2 4 7 1 4 1 ( 1 9 8 2 ) . 8JPS a n gR J . W .T r u s c o t t J A s s o c . O f fA n a lC h e m .6 78 2 9( 1 9 8 4 ) . 9R J WT r u s c o t t D GB u r k
