第3章细胞工程10

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1、第3章 细胞工程第第3 3章章 细胞工程细胞工程2contents3.1 细胞工程的基本技胞工程的基本技术3.2 植物植物细胞工程胞工程3.3 动物物细胞工程胞工程3.4 单克隆抗体克隆抗体3.5 核移植与克隆核移植与克隆动物物3.6 干干细胞胞3.7 iPS技技术第第3 3章章 细胞工程细胞工程3.1 3.1 细胞工程的基本技术细胞工程的基本技术细胞工程实验室的常见设备细胞工程实验室的常见设备细胞培养的基本方法细胞培养的基本方法3第第3 3章章 细胞工程细胞工程3.1.1细胞工程实验室的常见设施细胞工程实验室的常见设施灭菌锅灭菌锅电热干燥箱电热干燥箱超净工作台超净工作台倒置显微镜倒置显微镜细

2、胞计数板细胞计数板4电热鼓风干燥箱电热鼓风干燥箱手提式高压灭菌锅手提式高压灭菌锅立式高压灭菌锅立式高压灭菌锅垂直双人双面超净工作台垂直双人双面超净工作台离心机离心机光照培养箱光照培养箱CO2培养箱培养箱液氮罐液氮罐第第3 3章章 细胞工程细胞工程5倒置显微镜倒置显微镜细胞计数板细胞计数板动物细胞培养中用于观察细胞的生长状况及计数。动物细胞培养中用于观察细胞的生长状况及计数。第第3 3章章 细胞工程细胞工程6CO2培养箱（动物细胞培养）培养箱（动物细胞培养）光照培养箱（植物细胞培养）光照培养箱（植物细胞培养）CO2培养箱主要控制模拟活体内环境培养箱主要控制模拟活体内环境相关的相关的3个基本变量：

3、稳定的个基本变量：稳定的CO2水水平、温度、相对湿度。平、温度、相对湿度。第第3 3章章 细胞工程细胞工程7液氮罐（用于冻存培养的动物细胞）液氮罐（用于冻存培养的动物细胞）第第3 3章章 细胞工程细胞工程83.1.2细胞培养的基本方法细胞培养的基本方法无菌操作无菌操作 细胞工程的所有试验都要求在无菌条件下细胞工程的所有试验都要求在无菌条件下进行，要求十分严格的无菌操作。进行，要求十分严格的无菌操作。 1 1、准备室、接种室、培养室准备室、接种室、培养室（紫外线、熏蒸等）；（紫外线、熏蒸等）； 2 2、超净工作台、高压灭菌设备、过滤器；、超净工作台、高压灭菌设备、过滤器； 3 3、生物材料生物材

4、料的消毒的消毒（酒精、升汞、次氯酸钠等）（酒精、升汞、次氯酸钠等）； 4 4、试验器械试验器械、器皿器皿的灭菌的灭菌（干热、湿热）；（干热、湿热）； 5 5、药品药品、培养基培养基的灭菌的灭菌（湿热、过滤）；（湿热、过滤）；第第3 3章章 细胞工程细胞工程9细胞培养技术细胞培养技术细胞培养是指动物、植物或微生物细胞在体外无细胞培养是指动物、植物或微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。菌条件下的保存和生长。( (微生物培养、植物细胞微生物培养、植物细胞培养、动物细胞培养培养、动物细胞培养) )基本步骤包括：基本步骤包括：1.1.获取原材料及除菌；获取原材料及除菌；2.2.配制培养基，对培养基进

5、行灭菌；配制培养基，对培养基进行灭菌；3.3.接种、培养和传代。接种、培养和传代。第第3 3章章 细胞工程细胞工程10细胞融合技术细胞融合技术离体条件下将不同生物或同种生物不同类型离体条件下将不同生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。的技术。 单克隆抗体单克隆抗体细胞融合技术的主要过程：细胞融合技术的主要过程：制备原生质体（植物）；制备原生质体（植物）；诱导细胞融合（化学融合剂介导、电融合、诱导细胞融合（化学融合剂介导、电融合、病毒融合剂介导等）；病毒融合剂介导等）；筛选杂合细胞。筛选杂合细胞。第第3 3章章 细胞工程细胞工程

6、11核移植核移植用机械的办法将供体细胞的细胞核转移至另一个受用机械的办法将供体细胞的细胞核转移至另一个受体细胞（去除细胞核）中，并使这个重组细胞进一体细胞（去除细胞核）中，并使这个重组细胞进一步发育、分化。步发育、分化。克隆羊克隆羊DollyDolly第第3 3章章 细胞工程细胞工程123.2植物细胞工程植物细胞工程1 几个基本概念几个基本概念2 组织培养的基本方法培养的基本方法3 快速繁殖技快速繁殖技术4 植物脱毒技植物脱毒技术5 次生物次生物质与植物与植物细胞的大量培养胞的大量培养6 原生原生质体培养与体培养与细胞融合胞融合7 人工种子人工种子第第3 3章章 细胞工程细胞工程13细胞的全能

7、性细胞的全能性(totipotence)(totipotence)1902年：德国植物学家哈伯兰德（年：德国植物学家哈伯兰德（Haberlandt）就预言，）就预言，植物细胞具有全能性，即植物活细胞具有能够发育成为完整植物细胞具有全能性，即植物活细胞具有能够发育成为完整植株的潜在能力。植株的潜在能力。1943年，怀特明确提出了年，怀特明确提出了“植物细胞全能性植物细胞全能性”学说：每个学说：每个植物细胞具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能植物细胞具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。力。植物细胞的全能性，是植物细胞工程创立的重要理论基础。植物细胞的全能性，是植物细胞工程创立的

8、重要理论基础。1997年多利羊诞生证明了动物细胞全能性年多利羊诞生证明了动物细胞全能性3.2.1几个基本概念几个基本概念*第第3 3章章 细胞工程细胞工程14外植体、愈伤组织外植体、愈伤组织外植体：外植体：从健康植株的特定部位或组织，选择用于组织培养从健康植株的特定部位或组织，选择用于组织培养的起始材料，称之为外植体。可以是器官、组织、细胞和原的起始材料，称之为外植体。可以是器官、组织、细胞和原生质体等（如：花粉、茎段、叶片、茎尖、胚等）。生质体等（如：花粉、茎段、叶片、茎尖、胚等）。愈伤组织：愈伤组织：原指从植物的伤口部位生成的脱分化的薄壁细胞原指从植物的伤口部位生成的脱分化的薄壁细胞团。组

9、织培养时团。组织培养时,则指在培养基上从外植体上长出的一团无则指在培养基上从外植体上长出的一团无序薄壁细胞。它具有再分化成为完整植物体的潜能。序薄壁细胞。它具有再分化成为完整植物体的潜能。水稻幼胚水稻幼胚水稻愈伤组织水稻愈伤组织*第第3 3章章 细胞工程细胞工程15细胞分化、脱分化、再分化细胞分化、脱分化、再分化分化（分化（diffrentiation)：细胞的形态、构造和功能发生变化，：细胞的形态、构造和功能发生变化，如花芽分化，木质部分化，不定胚分化；如花芽分化，木质部分化，不定胚分化；脱分化（脱分化（dediffrentiation)：培养条件下使一个已分化的细：培养条件下使一个已分化的

10、细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化；分化；再分化（再分化（rediffrentiation)：将脱分化的母细胞再培养成分：将脱分化的母细胞再培养成分化细胞，并且形成组织或器官以及生物体；化细胞，并且形成组织或器官以及生物体；水稻幼胚水稻幼胚水稻愈伤组织水稻愈伤组织脱分化脱分化分化出苗分化出苗再分化再分化第第3 3章章 细胞工程细胞工程16植物细胞培养的培养基植物细胞培养的培养基糖（碳源），氨基酸，维生素等糖（碳源），氨基酸，维生素等水：水：大量元素：大量元素： K,Ca,Mg,P,SK,Ca,Mg,P,S等等微量元素：

11、微量元素：Cl,Fe,Mn,B,Zn,Cu,CoCl,Fe,Mn,B,Zn,Cu,Co等等无机营养：无机营养：蒸馏水或去离子水蒸馏水或去离子水有机营养：有机营养：生长调节物质：生长调节物质：生长素：生长素：2 2，4 4D D，NAANAA，IAAIAA等。等。促进根的分化促进根的分化细胞分裂素：细胞分裂素：6 6BABA，玉米素，激动素等，玉米素，激动素等，促进芽的分化促进芽的分化天然附加物：天然附加物：椰乳，酵母提取物，麦芽浸出物等椰乳，酵母提取物，麦芽浸出物等植物生长所必须的元素：植物生长所必须的元素：大量元素（大量元素（9种）：种）：C、H、O、N、K、Ca、Mg、P、S微量元素（微量

12、元素（7种）：种）：Cl、Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mu*第第3 3章章 细胞工程细胞工程173.2.2组织培养的基本方法组织培养的基本方法进行植物组织培养，一般要经历以下五个阶段进行植物组织培养，一般要经历以下五个阶段：1.1.材料的准备；材料的准备；2.2.接种与培养；接种与培养；3.3.继代增殖；继代增殖；4.4.诱导分化、生根成芽；诱导分化、生根成芽；5.5.移栽、炼苗成活。移栽、炼苗成活。*第第3 3章章 细胞工程细胞工程18水稻幼胚水稻幼胚水稻成熟胚水稻成熟胚愈伤组织愈伤组织分化出苗分化出苗诱导成芽诱导成芽诱导生根诱导生根( (底面观底面观) )诱导生根（侧面观）诱导生根（侧面观

13、）移栽、炼苗移栽、炼苗第第3 3章章 细胞工程细胞工程19第第3 3章章 细胞工程细胞工程203.2.3快速繁殖技术快速繁殖技术植物快速繁殖技术（植物快速繁殖技术（快繁快繁）：利用组织培养方法将植物体某一）：利用组织培养方法将植物体某一部分的组织小块，进行培养并诱导分化成大量的小植株，从而部分的组织小块，进行培养并诱导分化成大量的小植株，从而达到快速无性繁殖的目的。也称为试管苗繁殖或微体繁殖。达到快速无性繁殖的目的。也称为试管苗繁殖或微体繁殖。快繁技术最早在兰花工业上获得成功。在快繁技术最早在兰花工业上获得成功。在2020平方米的培养室内，最多可容纳平方米的培养室内，最多可容纳100100万万

14、株试管苗。株试管苗。*第第3 3章章 细胞工程细胞工程21第第3 3章章 细胞工程细胞工程223.2.4植物脱毒技术植物脱毒技术是植物快繁的一个分枝是植物快繁的一个分枝1952 1952 年，法国科学家首次建立了生长点培养成株的年，法国科学家首次建立了生长点培养成株的脱毒法，从而开创了防治植物病毒病的新途径。脱毒法，从而开创了防治植物病毒病的新途径。对植物病毒病迄今已采用的生物、物理、化学等多对植物病毒病迄今已采用的生物、物理、化学等多种防治途径均收效甚微，有的毫无成效。因此，过种防治途径均收效甚微，有的毫无成效。因此，过去人们只能采取拔除并消毁病株的消极方法。去人们只能采取拔除并消毁病株的消

15、极方法。第第3 3章章 细胞工程细胞工程23原理原理在感染病毒的植株中，病毒的分布是不一致的。老在感染病毒的植株中，病毒的分布是不一致的。老叶片及成熟组织和器官中，病毒含量较高，但幼嫩叶片及成熟组织和器官中，病毒含量较高，但幼嫩的和未成熟的植物部位（如茎尖分生组织），病毒的和未成熟的植物部位（如茎尖分生组织），病毒的含量较低，而在生长点约的含量较低，而在生长点约0.10.11 1 毫米时，则几乎毫米时，则几乎不含病毒颗粒。这是由于病毒的繁殖运输速度与茎不含病毒颗粒。这是由于病毒的繁殖运输速度与茎尖细胞生长速度不同所致。在茎尖分生组织中，细尖细胞生长速度不同所致。在茎尖分生组织中，细胞繁殖十分迅

16、速，病毒还来不及侵入，因此就成为胞繁殖十分迅速，病毒还来不及侵入，因此就成为植物体相对无病毒的特殊区域。植物体相对无病毒的特殊区域。第第3 3章章 细胞工程细胞工程24采取不含病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的采取不含病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的0.10.10.5 0.5 毫米带毫米带1 12 2 个叶原基的茎尖作为外植体，进行微繁个叶原基的茎尖作为外植体，进行微繁殖，使其培养成完整的无病毒小植株的技术。殖，使其培养成完整的无病毒小植株的技术。所取的外植体很小，分离难度大，所取的外植体很小，分离难度大，一般在解剖镜下一般在解剖镜下操作。操作。马铃薯、洋葱、大蒜、兰花、菊花、康乃馨、水仙、马铃薯、洋葱

17、、大蒜、兰花、菊花、康乃馨、水仙、唐菖蒲、香蕉、苹果、柑橘、葡萄等。唐菖蒲、香蕉、苹果、柑橘、葡萄等。第第3 3章章 细胞工程细胞工程25华中农大马铃薯脱毒试管苗华中农大马铃薯脱毒试管苗 http:/ 3章章 细胞工程细胞工程3.2.5次生物质与植物细胞的大量培养次生物质与植物细胞的大量培养次生代谢产物是指生物中一大类并非生长发育所必次生代谢产物是指生物中一大类并非生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。器官组织和生长发育期的特异性。那些应用价值高，价格昂贵，资源不足，难以进行那些应用价值高，价格昂贵

18、，资源不足，难以进行化学合成的植物次生物质，用细胞培养生产才会有化学合成的植物次生物质，用细胞培养生产才会有经济上的效益。经济上的效益。2619561956年，提出工业化培养植物细胞以生产其年，提出工业化培养植物细胞以生产其天然产物。之后，用此方法生产了紫草宁、天然产物。之后，用此方法生产了紫草宁、哈尔碱、麻黄碱、人参皂角苷、紫杉醇等。哈尔碱、麻黄碱、人参皂角苷、紫杉醇等。本草纲目本草纲目中所开列的中所开列的18921892种药物中绝大种药物中绝大多数是植物；目前约有多数是植物；目前约有25%25%的法定药品来自植的法定药品来自植物。物。第第3 3章章 细胞工程细胞工程27第一个商品化的细胞大

19、规模培养的植物是第一个商品化的细胞大规模培养的植物是紫草紫草。19831983年，日本三井石油化学工业公司利用紫草年，日本三井石油化学工业公司利用紫草细胞大规模培养生产紫草宁，最终浓度达细胞大规模培养生产紫草宁，最终浓度达1400mg/L1400mg/L，宣布把紫草宁作为燃料和药物进行，宣布把紫草宁作为燃料和药物进行工业化生产。工业化生产。在摇床扩大培养的长春花细胞在摇床扩大培养的长春花细胞紫草紫草我国已经建立了人参、三七我国已经建立了人参、三七、西洋参西洋参、三尖杉三尖杉、紫草、紫草、洋地黄、长春花、丹参、红豆杉等洋地黄、长春花、丹参、红豆杉等4040多种药用植物的液多种药用植物的液体培养系

20、统，并对长春花、人参、紫草、红豆杉等进行体培养系统，并对长春花、人参、紫草、红豆杉等进行大规模培养的探索。大规模培养的探索。长春花长春花第第3 3章章 细胞工程细胞工程28红豆杉红豆杉红豆杉树皮中提取的紫杉醇对治疗卵巢癌和红豆杉树皮中提取的紫杉醇对治疗卵巢癌和乳腺癌有特效。这种物质的碳环结构十分特殊，乳腺癌有特效。这种物质的碳环结构十分特殊，难以通过化学合成获得。然而要治好一个卵巢难以通过化学合成获得。然而要治好一个卵巢癌病妇，至少需要癌病妇，至少需要2 23 3 棵棵60 60 老龄的此种树的老龄的此种树的树皮。这种树属于稀有树种，且生长很慢，若树皮。这种树属于稀有树种，且生长很慢，若不断取

21、用的话，很快就要面临濒危的境地。不断取用的话，很快就要面临濒危的境地。我国传统药材生物技术产物第一个我国传统药材生物技术产物第一个商品化的例子：商品化的例子：人参人参，中国药科大，中国药科大学组培室学组培室人参人参第第3 3章章 细胞工程细胞工程293.2.6原生质体培养与细胞融合原生质体培养与细胞融合是是指指将将不不同同来来源源的的原原生生质质体体( (除除去去细细胞胞壁壁的的细细胞胞) )相相融融合合并并使使之之分分化化再再生生、形形成新物种或新品种的技术。成新物种或新品种的技术。可可以以避避开开生生殖殖细细胞胞的的受受精精过过程程，在在亲亲缘缘更更远远的的物物种种间间实实现现基基因因转转

22、移移，创创造造出出自然界中所没有的新物种。自然界中所没有的新物种。目目前前仍仍以以种种内内和和种种间间的的细细胞杂种为主。胞杂种为主。显微镜下的细胞融合过程显微镜下的细胞融合过程 第第3 3章章 细胞工程细胞工程30细胞融合的方法细胞融合的方法物理法（电）、化学法（化学融合剂）及生物法物理法（电）、化学法（化学融合剂）及生物法（病毒融合剂）。（病毒融合剂）。原理：增加细胞间的粘附、改变膜的通透性原理：增加细胞间的粘附、改变膜的通透性随随机结合、融合机结合、融合植物细胞融合常用植物细胞融合常用PEGPEG法和电融合法。法和电融合法。目前，最常用的植物细胞融合技术，有高国楠建立的使用化学融合剂目前

23、，最常用的植物细胞融合技术，有高国楠建立的使用化学融合剂PEG（聚乙二醇）的融合技术（聚乙二醇）的融合技术（1974），森达和乔默尔曼创立和发展的），森达和乔默尔曼创立和发展的电融合技术，以及斯维格（电融合技术，以及斯维格（1987）将电融合与微培养结合起来的技术。）将电融合与微培养结合起来的技术。第第3 3章章 细胞工程细胞工程31植物原生质体融合过程植物原生质体融合过程第第3 3章章 细胞工程细胞工程323.2.7人工种子人工种子人工种子又称人造种子，这是细胞工程中最年轻的人工种子又称人造种子，这是细胞工程中最年轻的一项新兴技术。由英国科学家于一项新兴技术。由英国科学家于19781978年

24、提出的。年提出的。天然种子，一般都是由种皮、胚乳和胚三部分构成。天然种子，一般都是由种皮、胚乳和胚三部分构成。人工种子是由人工种子是由体细胞胚、人工胚乳和人工种皮体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三个三个部分组成。部分组成。第第3 3章章 细胞工程细胞工程33体细胞胚体细胞胚胚不一定从受精卵发育来，尤其在植物界，胚不一定从受精卵发育来，尤其在植物界，往往可以看到未受精的卵细胞或胚囊细胞往往可以看到未受精的卵细胞或胚囊细胞、珠心细胞等发育成胚的现象。、珠心细胞等发育成胚的现象。由体细胞发育成的类似于合子胚的结构成由体细胞发育成的类似于合子胚的结构成为胚状体或体细胞胚，简称为胚状体或体细胞胚，简称体胚体

25、胚。体胚具有两极性，可从方向相反的两端分体胚具有两极性，可从方向相反的两端分化出茎和根。因此，体胚可以一次性再生化出茎和根。因此，体胚可以一次性再生成完整植株。成完整植株。把体胚包埋在胶囊内形成球状结构，使其把体胚包埋在胶囊内形成球状结构，使其具备种子机能。所以，人工种子是一种人具备种子机能。所以，人工种子是一种人工制造的代替天然种子的颗粒体，可以直工制造的代替天然种子的颗粒体，可以直接播种于田间。接播种于田间。http:/ 3章章 细胞工程细胞工程34包埋介质海藻酸钠包埋介质海藻酸钠这种物质在这种物质在0.1M0.1M氯化钙溶液中可以迅速固化成透明氯化钙溶液中可以迅速固化成透明的小胶球。海藻

26、酸价格低廉，质地柔软无毒性，还的小胶球。海藻酸价格低廉，质地柔软无毒性，还可人为地在其中加入各种营养物质和生长调节剂，可人为地在其中加入各种营养物质和生长调节剂，因此是一种，迄今为止已发现的比较理想的体细胞因此是一种，迄今为止已发现的比较理想的体细胞胚包埋剂。胚包埋剂。美国的一个研究组花了近两年时间，从百余种材料中筛选美国的一个研究组花了近两年时间，从百余种材料中筛选到目前广泛使用的人工种子包埋介质海藻酸钠。到目前广泛使用的人工种子包埋介质海藻酸钠。第第3 3章章 细胞工程细胞工程35三大难题有待克服三大难题有待克服许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细许多重要植物还不能培养出大量的高质量

27、的体细胞胚。胞胚。现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微生物的腐蚀。防止微生物的腐蚀。人工种子的贮藏有待进一步完善。人工种子的贮藏有待进一步完善。目前已制成模式性人工种子的植物十余种，但距离实际应用目前已制成模式性人工种子的植物十余种，但距离实际应用还有很大距离。还有很大距离。第第3 3章章 细胞工程细胞工程36要点要点外植体、愈伤组织、体细胞胚、人工种子外植体、愈伤组织、体细胞胚、人工种子植物细胞培养的优点？植物细胞培养的优点？植物组织（细胞）培养的基本过程？植物组织（细胞）培养的基本过程？植物脱毒技术原理？植物脱毒技术原理？植物原生质体如

28、何制备？植物细胞融合的方法？植物原生质体如何制备？植物细胞融合的方法？植物细胞工程有何应用前景？植物细胞工程有何应用前景？第第3 3章章 细胞工程细胞工程373.3动物细胞工程动物细胞工程3.3.1动物细胞培养动物细胞培养3.3.2动物细胞培养的基本过程动物细胞培养的基本过程3.3.3体外培养的动物细胞的生长类型体外培养的动物细胞的生长类型3.3.4动物细胞培养条件动物细胞培养条件3.3.5动物细胞的冻存与复苏动物细胞的冻存与复苏3.3.6动物细胞培养应用动物细胞培养应用第第3 3章章 细胞工程细胞工程383.3.1动物细胞培养动物细胞培养动物细胞（组织）培养：从动物体内取出细胞（或动物细胞（

29、组织）培养：从动物体内取出细胞（或组织），模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰组织），模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞（或组织）生存、生富的营养条件下，使离体细胞（或组织）生存、生长并维持结构和功能。长并维持结构和功能。起源于起源于1919世纪所应用的某些胚胎学技术。世纪所应用的某些胚胎学技术。奠基人奠基人: :美国生物学家哈里森。在美国生物学家哈里森。在19071907年采用盖玻片年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周时间，并观察到细胞突淋巴液中，保持存活了几周时间，并观察到细

30、胞突起的生长过程。起的生长过程。第第3 3章章 细胞工程细胞工程39培培养养器器具具过滤器过滤器离心管离心管培养瓶培养瓶冻存管冻存管第第3 3章章 细胞工程细胞工程40几个概念几个概念原代培养期（原代培养期（1010代细胞以内）代细胞以内）传代培养期（传代培养期（1010代细胞以后）代细胞以后）细胞株细胞株：（：（10-5010-50代细胞）代细胞）细胞系：（细胞系：（5050代细胞以后，细胞发生了癌变）代细胞以后，细胞发生了癌变）第第3 3章章 细胞工程细胞工程41原代培养原代培养(primaryculture)把第把第1 1代细胞的培养与代细胞的培养与传传1010代以内的细胞培养代以内的细

31、胞培养统称为统称为原代培养。原代培养。过程：从动物机体中取出组织 剪碎 加胰蛋白酶 细胞游离 加培养液 将细胞接种到培养瓶内 培养（12天换一次培养液） 细胞贴壁生长 长成单层细胞*细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。 第第3 3章章 细胞工程细胞工程42传代培养传代培养(subculture)体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，并维持

32、细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以细胞分散，从容器中取出，以1:21:2或或l:3l:3以上的比率转移以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 *第第3 3章章 细胞工程细胞工程43细胞株：细胞株：从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到能传到40-5040-50代代，其遗传物质没有发生变化。，其遗传物质没有发生变化。细胞系：细胞系：体外培养的动物细胞传到体外培养

33、的动物细胞传到40-5040-50代后有部分细胞遗传代后有部分细胞遗传物质发生了变化，带有癌变的特点，可能在培养条件物质发生了变化，带有癌变的特点，可能在培养条件下下无限制的传代无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。下去，这种传代细胞称为细胞系。*第第3 3章章 细胞工程细胞工程44v在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的蛋白质。动物细胞培养适宜的pHpH为为7.27.27.47.4，此环境下胃蛋白酶（最适，此环境下胃蛋白酶（最适pH2.0pH2.0）没有活性，而胰蛋白酶）没

34、有活性，而胰蛋白酶(7.2-(7.2-8.4)8.4)的活性较高。的活性较高。3.3.2动物细胞培养的基本过程动物细胞培养的基本过程选材：选材：多选择动物胚胎或幼龄动物的组织、器官多选择动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，因为它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度因为它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。低，容易培养。第第3 3章章 细胞工程细胞工程45基本过程：基本过程：动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶10代细胞代细胞原代培养的细胞原代培养的细胞50代细胞代细胞细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系单个细胞单个细胞加

35、培养液加培养液遗传物质遗传物质未改变未改变动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。（分解弹性纤维）（分解弹性纤维）遗传物质遗传物质已改变已改变*第第3 3章章 细胞工程细胞工程463.3.3体外培养的动物细胞的生长类型体外培养的动物细胞的生长类型离体培养的动物细胞可分为三类：离体培养的动物细胞可分为三类：贴壁依赖性贴壁依赖性贴壁非依赖性贴壁非依赖性兼性贴壁细胞。兼性贴壁细胞。第第3 3章章 细胞工程细胞工程47贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞需有给予需有给予贴附的支持物表面

36、，细胞依靠自身分泌的或培养贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴壁因子才能在该表面上生长、增殖。基中提供的贴壁因子才能在该表面上生长、增殖。这样的细胞称为这样的细胞称为贴壁细胞贴壁细胞；当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面。重新布满创面。 要求：要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。易于贴附。*第第3 3章章 细胞工程细胞工程48接触抑制（接触抑制（contactinhibition）当贴壁

37、细胞分裂生长到表当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象停止分裂增殖，这种现象称为称为细胞的接触抑制细胞的接触抑制。 正常二倍体细胞的生长寿正常二倍体细胞的生长寿命是有限的，而异倍体细命是有限的，而异倍体细胞无接触抑制现象，其寿胞无接触抑制现象，其寿命是无限的，如肿瘤细胞。命是无限的，如肿瘤细胞。*第第3 3章章 细胞工程细胞工程49肺癌细胞肺癌细胞SPC-A1（上皮样上皮样）肝癌细胞肝癌细胞SMMC-7721（成纤维样成纤维样）第第3 3章章 细胞工程细胞工程50培养中的胃癌细胞培养中的胃癌细胞MGC-803（多层）（多层）第第3 3章章 细胞

38、工程细胞工程51贴壁非依赖性细胞贴壁非依赖性细胞体体外外生生长长不不必必贴贴壁壁，可可在在培培养养液液中中悬悬浮浮生生长长，细细胞胞透透明明度度较大，边缘不是那么清晰，故也叫悬浮型细胞。较大，边缘不是那么清晰，故也叫悬浮型细胞。一一些些在在体体内内原原本本就就以以悬悬浮浮状状态态生生长长的的细细胞胞，当当接接种种于于体体外外环境中也可以以悬浮状态生长。环境中也可以以悬浮状态生长。血血液液白白细细胞胞、淋淋巴巴组组织织细细胞胞，某某些些肿肿瘤瘤细细胞胞、杂杂交交瘤瘤细细胞胞、转转化化细细胞胞系系等等都都属属此此类类细细胞胞。这这类类细细胞胞形形态态学学特特点点是是胞胞体体始终为球形。始终为球形。

39、兼性细胞兼性细胞生长不严格依赖支持物。如中国地生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。细胞。第第3 3章章 细胞工程细胞工程523.3.4动物细胞培养条件动物细胞培养条件1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养要求高、营养要求高（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清动物血清等。）等。）3、环境要求高：温度和、环境要求高：温度和pH36.5+0.5度度,7.2-7.44、气体环境：、气体环境： O2和和CO2（95%空气和空气和5%CO2）

40、保证细胞顺利的保证细胞顺利的生长增殖生长增殖不同血清对细胞作用不同。以小牛血清最好，成年牛和马血清次之。不同血清对细胞作用不同。以小牛血清最好，成年牛和马血清次之。第第3 3章章 细胞工程细胞工程533.3.5动物细胞的冻存与复苏动物细胞的冻存与复苏冷冻保存冷冻保存：将体外培养物或生物活性材料悬浮在加：将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加有或不加冷冻保护剂冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于降至零下某一温度（一般是低于-70-70的超低温条件）的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。，并在此温度下对其长期保存的过程。复苏复苏：

41、以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生：以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。物活性材料恢复到常温的过程。在复苏时，一般以很快的速度升温，在复苏时，一般以很快的速度升温，1-21-2分钟内即恢分钟内即恢复到常温。复到常温。*第第3 3章章 细胞工程细胞工程54冷冻保存方法冷冻保存方法最常用的方法：利用各种温最常用的方法：利用各种温级的冰箱分阶段降温至级的冰箱分阶段降温至-70 -70 -80 -80 ，然后直接投，然后直接投入液氮进行保存；或者是利入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一及利用液氮的气、液，按一

42、定的降温速率从室温降至定的降温速率从室温降至- -1000C1000C以下，再直接投入液氮以下，再直接投入液氮保存的方法。保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。或多或少都有冰晶的形成。第第3 3章章 细胞工程细胞工程55获得细胞或细获得细胞或细胞产物胞产物细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物个体或细胞植物个体或细胞培养结果培养结果快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物葡萄糖、动物血清血清蔗糖、植物激蔗糖、植物激素素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基

43、性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较植物细胞和动物细胞培养的比较第第3 3章章 细胞工程细胞工程563.3.6动物细胞培养应用动物细胞培养应用利用体外培养的动物细胞来大规模生产生物制品利用体外培养的动物细胞来大规模生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性物质的毒性为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据为治疗

44、和预防癌症及其他疾病提供理论依据第第3 3章章 细胞工程细胞工程57小结小结贴壁细胞、接触抑制、原代培养、传代培养、细胞贴壁细胞、接触抑制、原代培养、传代培养、细胞株、细胞系、冻存、复苏株、细胞系、冻存、复苏培养的动物细胞有哪些生长特性？培养的动物细胞有哪些生长特性？动物细胞培养与植物细胞培养有何不同？动物细胞培养与植物细胞培养有何不同？动物细胞培养的应用？动物细胞培养的应用？动物细胞融合的常用方法？动物细胞融合的常用方法？第第3 3章章 细胞工程细胞工程583.4单克隆抗体单克隆抗体长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，

45、然后从动物血清中分离出所需抗体的方射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。法。用这种方法获得的抗体，只能是混合抗体用这种方法获得的抗体，只能是混合抗体, ,产量低，特产量低，特异性差，纯度低，反应不够灵敏。异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B B细细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个要想获得大量的单一抗体，必须用单个

46、B B细胞进行无性细胞进行无性繁殖，即克隆。繁殖，即克隆。第第3 3章章 细胞工程细胞工程59什么是抗体？什么是抗体？由何种细胞产生？由何种细胞产生？主要分布在哪里？主要分布在哪里？起何作用？起何作用？什么是单什么是单克隆抗体？克隆抗体？B B细胞细胞血清血清特异性免疫作用特异性免疫作用抗体：机体受抗原刺激后产生的，并且抗体：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。功能的球蛋白。用单个用单个B B淋巴细胞进行无性增殖（扩增），也淋巴细胞进行无性增殖（扩增），也就是通过克隆，形成细胞群，这样的细胞群就就是通过克隆，形成细胞群，

47、这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体 单克隆抗体单克隆抗体3.4.1几个基本概念几个基本概念第第3 3章章 细胞工程细胞工程60传统传统抗血清抗血清抗抗原原免免疫疫所有所有抗体抗体混合混合1 23412341 234脾脾脏脏淋巴淋巴结结B细胞细胞一种抗原通常具一种抗原通常具有多个不同的抗有多个不同的抗原决定簇，因此原决定簇，因此能刺激多个能刺激多个B B淋巴淋巴细胞产生相应的细胞产生相应的单克隆抗体，因单克隆抗体，因此血清中的抗体此血清中的抗体是针对不同抗原是针对不同抗原决定族的单克隆决定族的单克隆抗体混合物，称抗体混合物，称为为多克隆

48、抗体多克隆抗体。传统方法获得的抗体是多克隆抗体传统方法获得的抗体是多克隆抗体(混合抗体混合抗体)第第3 3章章 细胞工程细胞工程61设计方案：设计方案：一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖化学性质单一、特异性强，化学性质单一、特异性强，只只针对一种抗原决定簇的抗体针对一种抗原决定簇的抗体。杂合细胞杂合细胞单克隆单克隆抗抗 体体3.4.2单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程*第第3 3章章 细胞工程细胞工程621975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适

49、应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与用绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（骨髓瘤细胞与用绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。抗体。第第3 3章章 细胞工程细胞工程63单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程注射抗原注射抗原B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选

50、，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小注射到小鼠腹腔鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体诱导其融合的方法诱导其融合的方法有哪些？有哪些？两次筛选分别两次筛选分别有什么目的？有什么目的？为什么选用小鼠骨髓为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与瘤细胞与B B细胞融合？细胞融合？*第第3 3章章 细胞工程细胞工程64杂杂交交瘤瘤细细胞胞产产生生单单克克隆隆抗抗体体示示意意图图第第3 3章章 细胞工程细胞工程65动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备腹腔注射、皮下淋巴样器官注射、静脉注射、皮内腹腔注射、皮下淋巴样器官注射、静脉注射、皮内注

51、射、肌肉注射等注射、肌肉注射等如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫3 3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。天以后的脾脏，制备成细胞悬液。 BALB/c mouse单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程第第3 3章章 细胞工程细胞工程66 小 白 鼠 免 疫 流 程抗原混合弗氏完全抗原混合弗氏完全佐剂进行初次免疫佐剂进行初次免疫至少三次相同剂至少三次相同剂量的加强免疫量的加强免疫效价测定效价测定最后一次加强免疫最后一次加强免疫取出脾脏，制备细胞悬液，细胞融合取出脾脏，制备细胞悬液，细胞融合BALB/c02468101214wk试采血试采血加加佐剂制成乳剂

52、佐剂制成乳剂佐剂佐剂:能使抗原缓慢能使抗原缓慢释放，以便延长抗释放，以便延长抗原与免疫系统接触原与免疫系统接触的时间；产生高亲的时间；产生高亲和力的免疫应答和力的免疫应答第第3 3章章 细胞工程细胞工程67免疫后取出脾脏免疫后取出脾脏第第3 3章章 细胞工程细胞工程68脾脏为脾脏为B B细胞集中地细胞集中地取出取出脾脏内细胞脾脏内细胞（无菌条件下操无菌条件下操作。作。）第第3 3章章 细胞工程细胞工程69PEGPEG介导细胞融合介导细胞融合细胞融合2 min加入 PEG第第3 3章章 细胞工程细胞工程70培养、筛选培养、筛选融合后的细胞均分在融合后的细胞均分在9696孔板中孔板中HAT培养基：

53、培养基：这一步筛选，主要是筛选出杂合的瘤细胞。这一步筛选，主要是筛选出杂合的瘤细胞。第第3 3章章 细胞工程细胞工程71 融合后的细胞生长状况融合后的细胞生长状况刚融合完成一个癌细胞与两个脾脏细胞经数次分裂后稳定的细胞群落稳定的细胞群落Juang RH (2003)第第3 3章章 细胞工程细胞工程72PEG脾脏细胞脾脏细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合细胞融合HAT初步筛选初步筛选杂合细胞杂合细胞ELISA筛选抗体筛选抗体mm11133332m143m12342mmmm3412mm431mmmmmm222444 4第第3 3章章 细胞工程细胞工程733.4.3单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用医学

54、检验试剂：主要用于特异性、敏感性要求高的的实验医学检验试剂：主要用于特异性、敏感性要求高的的实验技术中，如传染病的快速诊断；寻找肿瘤特异性抗原及检技术中，如传染病的快速诊断；寻找肿瘤特异性抗原及检测肿瘤相关抗原；免疫细胞抗原检测，等等（主要是利用测肿瘤相关抗原；免疫细胞抗原检测，等等（主要是利用抗原抗体的特异性反应检测特异性抗原）。抗原抗体的特异性反应检测特异性抗原）。导向治疗：生物导弹或免疫导弹导向治疗：生物导弹或免疫导弹抗原物质的分离和提纯：抗原物质的分离和提纯：亲和层析中作为配体，可筛选特亲和层析中作为配体，可筛选特异性抗原物质异性抗原物质第第3 3章章 细胞工程细胞工程743.5核移植

55、与克隆动物核移植与克隆动物第第3 3章章 细胞工程细胞工程75克隆的本意克隆的本意是指遗传上完全相是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体（植物界生物个体的无性繁殖群体（植物界试管植物；微生物试管植物；微生物分裂增分裂增殖；动物界殖；动物界孙悟空）。孙悟空）。克隆克隆1几个基本概念几个基本概念第第3 3章章 细胞工程细胞工程76（动物细胞的）核移植（动物细胞的）核移植将供体细胞核移入去核将供体细胞核移入去核的卵母细胞中的卵母细胞中, ,使后者使后者不经精子穿透等有性过不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并程即可被激活、分裂并发育发育,

56、 ,使得核供体的基使得核供体的基因得到完全复制。因得到完全复制。第第3 3章章 细胞工程细胞工程7719381938年，德国胚胎学家汉斯年，德国胚胎学家汉斯斯皮曼建议斯皮曼建议用用成年的细胞核成年的细胞核植入卵子的办法进行哺植入卵子的办法进行哺乳动物克隆。乳动物克隆。19521952年，美国人罗伯特年，美国人罗伯特布里格斯和布里格斯和T.J.T.J.金对豹蛙发育到金对豹蛙发育到胚囊期的胚胎细胞胚囊期的胚胎细胞做移做移核试验，成功地获得了一个可以摄食的核试验，成功地获得了一个可以摄食的豹蛙幼体。豹蛙幼体。19621962年，美国的发育生物学家约翰年，美国的发育生物学家约翰格登格登宣布他用一个宣布

57、他用一个成年细胞成年细胞克隆出一只蝌蚪，克隆出一只蝌蚪，从而引发了关于克隆的第一轮辩论。从而引发了关于克隆的第一轮辩论。19841984年，英国剑桥大学生物学家斯蒂恩年，英国剑桥大学生物学家斯蒂恩威拉德森用威拉德森用胚胎细胞克隆胚胎细胞克隆出一只羊。这出一只羊。这是第一例得到证实的克隆哺乳动物。是第一例得到证实的克隆哺乳动物。2动物克隆的发展历史动物克隆的发展历史1960年代初鱼类核移植工作在由中国实验胚胎学家童第周最早开展。年代初鱼类核移植工作在由中国实验胚胎学家童第周最早开展。第第3 3章章 细胞工程细胞工程78里程碑式的突破里程碑式的突破英国罗斯林（英国罗斯林（RoslinRoslin）

58、研究所维尔穆特）研究所维尔穆特(Wilmut)(Wilmut)博博士士19971997年年2 2月月2727日在日在NatureNature宣布用乳腺细胞的细宣布用乳腺细胞的细胞核成功克隆出一只绵羊胞核成功克隆出一只绵羊“ 多莉多莉 (Dolly) (Dolly) ” 。 维尔穆特等试验的生物学维尔穆特等试验的生物学意义是证明了哺乳动物的意义是证明了哺乳动物的体细胞也具有全能性。在体细胞也具有全能性。在此之前，人们从未能从哺此之前，人们从未能从哺乳动物的已分化的体细胞乳动物的已分化的体细胞再培育出基因相同的个体。再培育出基因相同的个体。但是，他们的试验尚未解但是，他们的试验尚未解决直接从体细胞

59、培养成成决直接从体细胞培养成成体的问题，他们还需借助体的问题，他们还需借助于卵细胞，即还要依赖卵于卵细胞，即还要依赖卵细胞的细胞质。细胞的细胞质。第第3 3章章 细胞工程细胞工程79克隆克隆“多莉多莉”示意图示意图一只怀孕三个月的芬兰一只怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，提供了多塞特母绵羊，提供了全套遗传信息，即提供全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）了细胞核（称之为供体）；两只是苏格兰黑面母绵两只是苏格兰黑面母绵羊。一只提供无细胞核羊。一只提供无细胞核的卵细胞（受体）；另的卵细胞（受体）；另一只提供羊胚胎的发育一只提供羊胚胎的发育环境环境子宫，是子宫，是“多莉多莉”羊的羊的“生生”母（代孕

60、母（代孕母体）。母体）。3哺乳动物进行克哺乳动物进行克隆的基本过程隆的基本过程*第第3 3章章 细胞工程细胞工程80具体操作具体操作从一只岁芬兰多塞特从一只岁芬兰多塞特白面母绵羊（）白面母绵羊（）的乳腺中的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中饥取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中饥饿，细胞逐渐停止分裂进入休眠状态而使全部基因饿，细胞逐渐停止分裂进入休眠状态而使全部基因具有活性，此细胞称之为具有活性，此细胞称之为“核供体细胞核供体细胞”；注射促性腺激素注射促性腺激素GNGN促使母羊（苏格兰促使母羊（苏格兰黑面母绵羊）黑面母绵羊）（）（）排卵，排卵，282833h33h后从卵巢中

61、取出未受精的卵细后从卵巢中取出未受精的卵细胞快速去除细胞核，放入胞快速去除细胞核，放入10%FCS10%FCS（小牛血清）、（小牛血清）、1%FCS1%FCS和和0.5%FCS0.5%FCS连续连续5 5天，饥饿使进入天，饥饿使进入G0G0期做受体细期做受体细胞；胞；第第3 3章章 细胞工程细胞工程81利用电脉冲融合方法，使供利用电脉冲融合方法，使供体细胞和受体细胞融合，最体细胞和受体细胞融合，最后形成后形成“融合细胞融合细胞”。电脉。电脉冲可以产生类似于自然受精冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、

62、分化，从而形行细胞分裂、分化，从而形成成“胚胎细胞胚胎细胞”；将胚胎细胞转移到另一只苏将胚胎细胞转移到另一只苏格兰格兰黑面母绵羊（）黑面母绵羊（）的子的子宫内，胚胎细胞进一步分化宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊和发育，最后形成小绵羊-多莉，它具有供体母羊多莉，它具有供体母羊（A A）全套的遗传物质，也）全套的遗传物质，也为白色。为白色。第第3 3章章 细胞工程细胞工程82成功率始终很低，具有极大的偶然性和随机性。成功率始终很低，具有极大的偶然性和随机性。277277个绵羊胚胎个绵羊胚胎1 1个多莉；个多莉；夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大；夭折率高，不少克隆动物天生患

63、有疾病或体形过大；没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。 4存在问题存在问题DollyDolly的命运：的命运：20032003年年2 2月月1414日，多莉因肺部感染无法日，多莉因肺部感染无法治愈而死亡，治愈而死亡，“享年享年”不足不足7 7岁。肺部岁。肺部感染是感染是11-1211-12岁的老年羊的常见病。岁的老年羊的常见病。19991999年，法国全国农业研究所的克隆年，法国全国农业研究所的克隆牛犊出生一月后死亡。尸体解剖发现牛犊出生一月后死亡。尸体解剖发现其脾脏、胸腺等组织未正常发育。其脾脏、胸腺等组织未正常发育。第

64、第3 3章章 细胞工程细胞工程831998年，美国夏威夷大学年，美国夏威夷大学 T.Wakayama等率先在雌性小鼠上进行了成等率先在雌性小鼠上进行了成年年体细胞克隆体细胞克隆体细胞克隆体细胞克隆。 1998年，日本成功进行体细胞克隆牛。年，日本成功进行体细胞克隆牛。 1998年，新西兰科学家从一头珍稀牛克隆后代。年，新西兰科学家从一头珍稀牛克隆后代。 1999年，美国夏威夷大学从雄性小鼠尾尖取材，获得克隆雄鼠。年，美国夏威夷大学从雄性小鼠尾尖取材，获得克隆雄鼠。 2000年，杨向中博士领导的实验室在美国从体外培养年，杨向中博士领导的实验室在美国从体外培养 6-13代的细胞克代的细胞克隆出隆出

65、 6头公牛。头公牛。 2000年，美国从衰老细胞克隆出年，美国从衰老细胞克隆出 6头小牛。头小牛。 2000年，英国从成年动物体细胞克隆出年，英国从成年动物体细胞克隆出 5头猪。头猪。 2000年，中国西北农林科技大学从年，中国西北农林科技大学从 4岁山羊耳上取细胞体外培养，克隆岁山羊耳上取细胞体外培养，克隆出出1头山羊。头山羊。 2001年，体细胞克隆狗诞生。年，体细胞克隆狗诞生。 2001年，体细胞克隆兔诞生。年，体细胞克隆兔诞生。 2002年，体细胞克隆猫诞生。年，体细胞克隆猫诞生。 2003年，体细胞克隆猴诞生。年，体细胞克隆猴诞生。 2004年，体细胞克隆大鼠诞生。年，体细胞克隆大鼠

66、诞生。 2005年，体细胞克隆马诞生。年，体细胞克隆马诞生。 第第3 3章章 细胞工程细胞工程84应用价值及意义应用价值及意义检验动物细胞全能性检验动物细胞全能性 加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物。加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物。生生殖性克隆殖性克隆克隆动物的遗传背景相同，因此它们是模拟疾病、克隆动物的遗传背景相同，因此它们是模拟疾病、基因治疗、器官移植等研究的良好实验材料，具有基因治疗、器官移植等研究的良好实验材料，具有良好的稳定性和重复性。良好的稳定性和重复性。可以用患者本人细胞培育出新组织（器官移植）。可以用患者本人细胞培育出新组织（器官移植）。治疗性克隆治疗性克隆第第3 3章

67、章 细胞工程细胞工程855生殖性克隆生殖性克隆人体细胞克隆技术人体细胞克隆技术生殖性克隆（克隆人）生殖性克隆（克隆人）治疗性克隆（克隆胚胎）治疗性克隆（克隆胚胎）出于医疗目的而在实验室使用克隆技术制造胚出于医疗目的而在实验室使用克隆技术制造胚胎，然后取出胚胎干细胞进行体外培养以获得胎，然后取出胚胎干细胞进行体外培养以获得再生组织或器官的过程。再生组织或器官的过程。“生殖性生殖性克隆克隆”：*指出于生殖的目的使用克隆技术在实验室制造指出于生殖的目的使用克隆技术在实验室制造人类胚胎，然后将胚胎置入人类子宫发育成胎人类胚胎，然后将胚胎置入人类子宫发育成胎儿和婴儿的过程。基于尊重人类尊严的伦理学儿和婴

68、儿的过程。基于尊重人类尊严的伦理学考虑，目前世界各国政府严禁生殖性克隆。考虑，目前世界各国政府严禁生殖性克隆。“治疗性治疗性克隆克隆”：第第3 3章章 细胞工程细胞工程86克隆人类？克隆人类？将普通的体细胞（男性或女性来源均可）和一枚女将普通的体细胞（男性或女性来源均可）和一枚女性卵子结合起来（储存于女性卵子中的遗传信息将性卵子结合起来（储存于女性卵子中的遗传信息将事先被消除）。通过细胞分裂形成的胚胎应只带有事先被消除）。通过细胞分裂形成的胚胎应只带有这名供体的全部遗传信息，最后将胚胎移植到女性这名供体的全部遗传信息，最后将胚胎移植到女性子宫中，将获得该供体人类的克隆后代。子宫中，将获得该供体

69、人类的克隆后代。第第3 3章章 细胞工程细胞工程87社会、伦理问题社会、伦理问题他（她）是正常人吗？该如何看待他（她）？他（她）是正常人吗？该如何看待他（她）？他（她）的父母是谁？他（她）的父母是谁？谁生育了他（她）？谁爱他（她）？谁生育了他（她）？谁爱他（她）？有可能产生真正相同的克隆的孪生子吗？有可能产生真正相同的克隆的孪生子吗？Whoami？不管克隆技术怎样发展，克隆人怎样产生，不管克隆技术怎样发展，克隆人怎样产生，都是人，与被克隆人实质上是存在着年龄都是人，与被克隆人实质上是存在着年龄差的同胞胎。但就是这一点让人们觉得很差的同胞胎。但就是这一点让人们觉得很难应对克隆人出现的伦理关系。难

70、应对克隆人出现的伦理关系。这个孩子就是人类的试验品，这位代孕的这个孩子就是人类的试验品，这位代孕的母体起到的也仅仅是一个生育机或孵化器母体起到的也仅仅是一个生育机或孵化器的作用。的作用。第第3 3章章 细胞工程细胞工程88英雄、伟人能够克隆吗？英雄、伟人能够克隆吗？身体上任何一部分的细胞是否都可以用来克隆身体上任何一部分的细胞是否都可以用来克隆？人可以无休止地被克隆吗？人可以无休止地被克隆吗？任何克隆动物都有基因上的缺陷。克隆羊和克任何克隆动物都有基因上的缺陷。克隆羊和克隆牛都有体形过度庞大的问题。该缺陷在克隆隆牛都有体形过度庞大的问题。该缺陷在克隆鼠身上也存在。克隆牛、羊、猪都存在发育不鼠身

71、上也存在。克隆牛、羊、猪都存在发育不良、免疫系统良、免疫系统 缺陷和心肺功能不健全的问题。缺陷和心肺功能不健全的问题。那么，克隆人呢？那么，克隆人呢？第第3 3章章 细胞工程细胞工程89克隆人是否是人类文明的倒退？克隆人是否是人类文明的倒退？（有性生殖，无性生殖（有性生殖，无性生殖克隆）克隆）第第3 3章章 细胞工程细胞工程901998年年1月，欧洲月，欧洲19个国家在法国巴黎签署了一项有关严格禁止克隆人的协议。个国家在法国巴黎签署了一项有关严格禁止克隆人的协议。这是国际上第一个禁止克隆人的文件。它禁止各签约国的研究机构或个人使用任何技这是国际上第一个禁止克隆人的文件。它禁止各签约国的研究机构

72、或个人使用任何技术创造与一个活人或死人基因相似的人，否则将重罚。术创造与一个活人或死人基因相似的人，否则将重罚。美国：美国：2001年年7月月31日，美国国会众议院通过了一项全面禁止克隆人的法案。美日，美国国会众议院通过了一项全面禁止克隆人的法案。美国总统布什表示国总统布什表示“百分之百百分之百”反对克隆人的研究，并已多次敦促参议院通过禁止克隆反对克隆人的研究，并已多次敦促参议院通过禁止克隆人的法案。人的法案。英国：英国：1990年通过的年通过的人类授精和胚胎学法案人类授精和胚胎学法案，认为克隆人类胚胎的研究是非，认为克隆人类胚胎的研究是非法的。法的。2001年年11月月22日英国政府公布一项

73、新法案，明确禁止通过克隆技术复制人类个日英国政府公布一项新法案，明确禁止通过克隆技术复制人类个体，即体，即“繁殖性克隆繁殖性克隆”，成为世界上第一个立法反对生殖性克隆的国家。，成为世界上第一个立法反对生殖性克隆的国家。德国：德国：1991年德国实行年德国实行胚胎保护法胚胎保护法，严格禁止人类胚胎干细胞研究以及克隆，严格禁止人类胚胎干细胞研究以及克隆胚胎干细胞。胚胎干细胞。2000年年11月，德国卫生部提出一项新的月，德国卫生部提出一项新的生殖医学法生殖医学法草案，再次强调草案，再次强调在德国不允许进行胚胎干细胞的培育研究。在德国不允许进行胚胎干细胞的培育研究。意大利：意大利：2001年年3月，

74、意大利众议院批准了政府于月，意大利众议院批准了政府于1998年签署加入欧洲禁止克隆年签署加入欧洲禁止克隆人协议。人协议。日本：日本：2000年年4月月14日，日本内阁会议通过关于日，日本内阁会议通过关于限制对人的克隆技术的法律草限制对人的克隆技术的法律草案案，禁止克隆人，违者最高将被判处，禁止克隆人，违者最高将被判处5年徒刑。年徒刑。世界一些国家对克隆人研究的态度：世界一些国家对克隆人研究的态度：第第3 3章章 细胞工程细胞工程91从需要救治的病人身上提取体细胞从需要救治的病人身上提取体细胞将该细胞的遗传物质置入一个去除了细胞核的卵细胞将该细胞的遗传物质置入一个去除了细胞核的卵细胞该卵细胞开始

75、自行分裂，直至形成一个早期胚胎该卵细胞开始自行分裂，直至形成一个早期胚胎从这早期胚胎中提取胚胎干细胞从这早期胚胎中提取胚胎干细胞胚胎干细胞经过相应的技术处理，便可发展成遗传特征与胚胎干细胞经过相应的技术处理，便可发展成遗传特征与病人完全吻合的细胞、组织或器官病人完全吻合的细胞、组织或器官以前器官移植治疗方法中经常出现的排异反应问题因此得到了彻底以前器官移植治疗方法中经常出现的排异反应问题因此得到了彻底解决解决血细胞、脑细胞、骨骼和内脏等都将可以更换血细胞、脑细胞、骨骼和内脏等都将可以更换癌症、白血病、帕金森氏症、心脏病等顽疾也有望得到有效的治疗癌症、白血病、帕金森氏症、心脏病等顽疾也有望得到有

76、效的治疗与治愈与治愈由于从早期人类胚胎中提取的干细胞拥有形成所有的人体细胞类型由于从早期人类胚胎中提取的干细胞拥有形成所有的人体细胞类型的能力，因而它也就有可能成为的能力，因而它也就有可能成为21世纪最重要、最理想的人体器世纪最重要、最理想的人体器官替代物的原料。官替代物的原料。6治疗性克隆治疗性克隆*第第3 3章章 细胞工程细胞工程92治疗性克隆人兽混合胚胎治疗性克隆人兽混合胚胎中国最早进行人兽混合胚胎实验，现已中断中国最早进行人兽混合胚胎实验，现已中断http:/ http:/ 3章章 细胞工程细胞工程93小结小结单抗、多抗、单抗、多抗、HATHAT培养基、治疗性克隆、生殖性克隆培养基、治

77、疗性克隆、生殖性克隆单抗的制备方法？应用？单抗的制备方法？应用？多利羊是如何克隆出来的？多利羊是如何克隆出来的？如何用体细胞克隆哺乳动物如何用体细胞克隆哺乳动物/ /鱼类？克隆动物有什么鱼类？克隆动物有什么实际应用？实际应用？将基因工程与克隆技术两者结合起来（即转移的细将基因工程与克隆技术两者结合起来（即转移的细胞核胞核DNADNA含有外源基因），能产生什么后果？（转基含有外源基因），能产生什么后果？（转基因动物，利用克隆技术）因动物，利用克隆技术）第第3 3章章 细胞工程细胞工程3.6干细胞干细胞94第第3 3章章 细胞工程细胞工程953.6.1定义定义目前尚无统一的说法目前尚无统一的说法干

78、细胞是一类具有自我更干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。新和分化潜能的细胞。or具有多项分化潜能和自我具有多项分化潜能和自我复制、更新能力的复制、更新能力的原始未原始未分化细胞分化细胞，是形成各种组，是形成各种组织器官的祖宗细胞。织器官的祖宗细胞。*第第3 3章章 细胞工程细胞工程96来源来源胚胎干细胞胚胎干细胞（embryonicstemcells,ESC）：）：指处于胚胎早期的干细胞。分化潜能宽，具有分化为指处于胚胎早期的干细胞。分化潜能宽，具有分化为机体任何组织细胞的能力，如囊胚期机体任何组织细胞的能力，如囊胚期(受精后受精后57天天)内内细胞团的细胞、原始生殖细胞细胞团的细胞、原

79、始生殖细胞3.6.2干细胞的分类干细胞的分类成体干细胞成体干细胞（adultstemcell，ASC）：）：具有自我更新能力，但分化潜能窄，只能分化为相应具有自我更新能力，但分化潜能窄，只能分化为相应(或相邻或相邻)组织器官组成的细胞，组织器官组成的细胞，如：如：骨髓、大脑、神经、骨髓、大脑、神经、皮肤、胰腺、角膜、脂肪、心脏、肝脏等组织源干细胞皮肤、胰腺、角膜、脂肪、心脏、肝脏等组织源干细胞*第第3 3章章 细胞工程细胞工程97分化分化潜能潜能单能单能/专能专能/偏能偏能/定向干细胞：只能向一种类型或密切相关的两定向干细胞：只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。如上皮组织基底层的干细

80、胞、肌肉中的成种类型的细胞分化。如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞肌细胞(卫星细胞卫星细胞)。全能干细胞：具有形成完整个体的分化潜全能干细胞：具有形成完整个体的分化潜能。如：受精卵、能。如：受精卵、8个细胞期以前的卵裂个细胞期以前的卵裂球以及胚胎干细胞（球以及胚胎干细胞（后者尚有争议）后者尚有争议）多能干细胞（多能干细胞（pluripotentstemcells）：具有分化出多种细胞组）：具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定限制。如骨髓多能造血干细胞，它可分化出至少十二种血细定限制。如骨髓多能

81、造血干细胞，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。*第第3 3章章 细胞工程细胞工程983.6.3干细胞的生物学特点干细胞的生物学特点具有自我更新能力和不同程度的多向分化潜具有自我更新能力和不同程度的多向分化潜能终生保持未分化或低分化特征，缺乏分化能终生保持未分化或低分化特征，缺乏分化标记能无限地分裂、增殖，可连续分裂几代，标记能无限地分裂、增殖，可连续分裂几代，也可在较长时间内保持静止状态也可在较长时间内保持静止状态*第第3 3章章 细胞工程细胞工程99干细胞有干细胞有对称对称与与不对称不对称两种分裂方式两种分裂方式不对称分裂

82、的结果使两个子细胞一个成为功能专不对称分裂的结果使两个子细胞一个成为功能专一的一的分化细胞分化细胞；另一个保持；另一个保持干细胞干细胞的特征。的特征。对称分裂：干细胞对称分裂：干细胞分裂分裂干细胞干细胞干细胞干细胞对称分裂：干细胞对称分裂：干细胞分裂分裂分化细胞分化细胞分化细胞分化细胞不对称分裂：干细胞不对称分裂：干细胞干细胞干细胞分化细胞分化细胞分裂分裂第第3 3章章 细胞工程细胞工程1003.6.4胚胎干细胞胚胎干细胞ES细胞：由细胞：由早期胚胎（囊胚期早期胚胎（囊胚期/胚泡期）胚泡期）或原始性腺中分离或原始性腺中分离出来的一类细胞（前者更常用），可冷冻保存，可进行遗传出来的一类细胞（前者

83、更常用），可冷冻保存，可进行遗传改造。改造。*第第3 3章章 细胞工程细胞工程101获得干细胞的四个途径获得干细胞的四个途径(1)从体外培养的早期胚胎获得；从体外培养的早期胚胎获得；(2)从早期流产的胎儿中获得；从早期流产的胎儿中获得；(3)从克隆的胚胎中获得；从克隆的胚胎中获得；(4)从成体中获得。从成体中获得。第第3 3章章 细胞工程细胞工程1从早期胚胎获得从早期胚胎获得1998年，美国威斯康辛大学年，美国威斯康辛大学Thompson研究小组研究小组就是从囊胚期胚胎的内细胞团中获得胚胎干细胞就是从囊胚期胚胎的内细胞团中获得胚胎干细胞102体外受精卵体外受精卵囊胚期囊胚期去除滋养层去除滋养层

84、发育发育得得5株干细胞系株干细胞系32代代(8个月个月)保持未分化状态保持未分化状态内细胞团内细胞团培养培养传代传代第第3 3章章 细胞工程细胞工程2从原始生殖细胞获得从原始生殖细胞获得103gearhart小组：小组：流产胎儿性腺嵴流产胎儿性腺嵴 原始生殖细胞原始生殖细胞 获得获得5个多能干细胞系个多能干细胞系 7个月不分化个月不分化 思路：原始生殖细胞是未分化细胞。思路：原始生殖细胞是未分化细胞。 培养培养分离分离培养培养第第3 3章章 细胞工程细胞工程3体细胞核移植体细胞核移植104分分化化细细胞胞核核(乳乳腺腺、皮皮肤肤细细胞胞) 去去核核卵卵细胞细胞杂合细胞杂合细胞 发育成囊胚发育成

85、囊胚移植到代孕母体子宫中，移植到代孕母体子宫中，发育发育移植到移植到刺激刺激成体成体(如如多利羊多利羊)获得胚胎干细胞获得胚胎干细胞分离出内细胞团分离出内细胞团第第3 3章章 细胞工程细胞工程105受精卵受精卵卵裂期卵裂期桑椹胚桑椹胚囊胚（内含囊胚腔）囊胚（内含囊胚腔）原肠胚（内含原肠腔）原肠胚（内含原肠腔）胎儿形成胎儿形成(2(21616细胞期细胞期) )：在透明带内进行有丝分裂，细胞数量不：在透明带内进行有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎总体积并不增加，或略有减少。断增加，但胚胎总体积并不增加，或略有减少。由具有全能性细胞构成，细胞数在由具有全能性细胞构成，细胞数在3232个左右，排列紧密

86、，个左右，排列紧密，形似桑椹，形似桑椹，至此，细胞的分裂结束，下一个阶段开始细胞至此，细胞的分裂结束，下一个阶段开始细胞分化。分化。 内细胞团：发育成胎儿各组织内细胞团：发育成胎儿各组织滋养层细胞：发育成胎膜和胎盘滋养层细胞：发育成胎膜和胎盘：最初发育在输卵管进行有丝分裂：最初发育在输卵管进行有丝分裂哺乳动物的胚胎发育哺乳动物的胚胎发育滋养层滋养层外胚层外胚层中胚层中胚层内胚层内胚层原肠腔原肠腔第第3 3章章 细胞工程细胞工程106囊胚期囊胚期滋养层：发育成胚胎的附属结构或胚外结构，胚胎可通过滋养层：发育成胚胎的附属结构或胚外结构，胚胎可通过这些组织从母体中获得正常发育所需的氧气和营养物质这些

87、组织从母体中获得正常发育所需的氧气和营养物质内细胞团细胞：即胚胎干细胞内细胞团细胞：即胚胎干细胞，是一种未分化的细，是一种未分化的细胞，胞，具有全能性具有全能性，能发育成完整的胚胎，能发育成完整的胚胎滋养层滋养层内细胞团内细胞团囊囊胚胚腔腔囊胚的形成囊胚的形成桑椹胚桑椹胚第第3 3章章 细胞工程细胞工程107胚胎干细胞的培养（分离）胚胎干细胞的培养（分离）*第第3 3章章 细胞工程细胞工程108胚胎干细胞的培养胚胎干细胞的培养第第3 3章章 细胞工程细胞工程109胚胎干细胞的应用前景胚胎干细胞的应用前景1 1）与基因治疗相结合）与基因治疗相结合2 2）再生医学：干细胞体外诱）再生医学：干细胞体

88、外诱导分化成某一特定的细胞、组导分化成某一特定的细胞、组织、器官，进行移植，使之再织、器官，进行移植，使之再建受损的组织甚至器官建受损的组织甚至器官3)3)生物体发育机制研究等生物体发育机制研究等*干细胞有可能用于治疗人类几乎所有干细胞有可能用于治疗人类几乎所有的组织坏死性或退化性疾病，它将是的组织坏死性或退化性疾病，它将是人类医疗史上的一次革命。人类医疗史上的一次革命。第第3 3章章 细胞工程细胞工程110由胚胎干细胞到组织器官，仍然在研究当中由胚胎干细胞到组织器官，仍然在研究当中第第3 3章章 细胞工程细胞工程1113.6.5胚胎干细胞研究的伦理争论胚胎干细胞研究的伦理争论从体外受精人胚中

89、获得的从体外受精人胚中获得的ES细胞在适当条件下能否发育成人？细胞在适当条件下能否发育成人？干细胞要是来自自愿终止妊娠的孕妇该如何办？干细胞要是来自自愿终止妊娠的孕妇该如何办？为获得为获得ES细胞而杀死人胚是否道德？细胞而杀死人胚是否道德？是不是良好的愿望为邪恶的手段提供了正当理由？是不是良好的愿望为邪恶的手段提供了正当理由？使用来自自发或事故流产胚胎的细胞是否恰当？使用来自自发或事故流产胚胎的细胞是否恰当？如果胚胎干细胞和胚胎生殖细胞可以作为细胞系而可买卖获取，科学家使用如果胚胎干细胞和胚胎生殖细胞可以作为细胞系而可买卖获取，科学家使用它们符合道德规范吗？它们符合道德规范吗？什么类型的研究可

90、被接受？什么类型的研究可被接受？允许科学家为研究发育过程或建立医学移植组织而培养个体组织和器官吗？允许科学家为研究发育过程或建立医学移植组织而培养个体组织和器官吗？由于目前已接受人体基因可以插入动物细胞中，将人胚胎干细胞嵌入家畜胚由于目前已接受人体基因可以插入动物细胞中，将人胚胎干细胞嵌入家畜胚胎中创立嵌合体来获得移植用人体器官是否道德？胎中创立嵌合体来获得移植用人体器官是否道德？为了治疗，改变来自有基因缺陷胚胎的为了治疗，改变来自有基因缺陷胚胎的ES细胞的基因，并使其继续发育成健细胞的基因，并使其继续发育成健康个体是否道德？康个体是否道德？如果人的替代组织极易获取，会不会有更多的人将不负责任

91、地生活，而从事如果人的替代组织极易获取，会不会有更多的人将不负责任地生活，而从事高风险的活动？高风险的活动？ http:/ 3章章 细胞工程细胞工程1123.7iPS技术技术iPS技术：诱导式多能干细胞技术。通过基因工程的方式将一些技术：诱导式多能干细胞技术。通过基因工程的方式将一些特定基因导入体细胞中，诱导这些体细胞重编程为类似干细胞特定基因导入体细胞中，诱导这些体细胞重编程为类似干细胞的细胞。的细胞。iPS细胞：诱导式多能干细胞细胞：诱导式多能干细胞(inducedpluripotentstemcell)3.7.1iPS细胞核技术的定义、出现背景细胞核技术的定义、出现背景3.7.22006

92、年：年：iPS在小鼠细胞上实现在小鼠细胞上实现3.7.32007年：年：iPS在人类细胞上实现在人类细胞上实现3.7.4进展进展3.7.5iPS细胞的应用细胞的应用第第3 3章章 细胞工程细胞工程1133.7.1iPS细胞核技术的定义、出现背景细胞核技术的定义、出现背景iPS技术：诱导式多能干细胞技术。通过一定的方式（如转基技术：诱导式多能干细胞技术。通过一定的方式（如转基因）将一些特定基因导入体细胞中，诱导这些体细胞重编程因）将一些特定基因导入体细胞中，诱导这些体细胞重编程为功能上类似干细胞的细胞。为功能上类似干细胞的细胞。iPS细胞细胞(诱导式多能干细胞，诱导式多能干细胞，inducedp

93、luripotentstemcell)：是指体细胞经过基因重：是指体细胞经过基因重编程，回归到胚胎干细胞的状态，从而具有类似胚胎干细胞编程，回归到胚胎干细胞的状态，从而具有类似胚胎干细胞的分化能力的分化能力*第第3 3章章 细胞工程细胞工程114background再生医学领域：器官移植（捐助的器官有限、异体移植会有再生医学领域：器官移植（捐助的器官有限、异体移植会有免疫排斥反应）免疫排斥反应）解决方法之一：直接采用多能干细胞进行器官再生（可惜通解决方法之一：直接采用多能干细胞进行器官再生（可惜通常所用的常所用的ES细胞来源于囊胚阶段的胚或者是受精后细胞来源于囊胚阶段的胚或者是受精后59周流周

94、流产的胚胎，而且产的胚胎，而且外来的外来的ES细胞会有免疫排斥反应细胞会有免疫排斥反应）之二：治疗性克隆（采用核移植技术将患者自身体细胞的细之二：治疗性克隆（采用核移植技术将患者自身体细胞的细胞核转移到捐助者的去核的卵细胞中，体外培养进行胚胎发胞核转移到捐助者的去核的卵细胞中，体外培养进行胚胎发育后获得人体早期胚胎，但目的不是将胚胎培育成人，而是育后获得人体早期胚胎，但目的不是将胚胎培育成人，而是从中提取胚胎干细胞，然后在合适的条件下，使其发育成为从中提取胚胎干细胞，然后在合适的条件下，使其发育成为人体的任何一个器官，包括心、肺、肾、肝等。这些器官组人体的任何一个器官，包括心、肺、肾、肝等。这

95、些器官组织可用于医疗。织可用于医疗。由于涉及卵细胞的操作和对胚胎的破坏，会由于涉及卵细胞的操作和对胚胎的破坏，会有一定的伦理、法律等的障碍有一定的伦理、法律等的障碍。）。）涉及：核移植技术和干细胞的分离与培养两个领域。涉及：核移植技术和干细胞的分离与培养两个领域。第第3 3章章 细胞工程细胞工程115iPS出现的前提：出现的前提：受精卵可发育成个体受精卵可发育成个体说明卵细胞具有分化全能说明卵细胞具有分化全能蝌蚪的分化细胞（肠）的细胞核移植进卵细胞后可指导其发育成个蝌蚪的分化细胞（肠）的细胞核移植进卵细胞后可指导其发育成个体（体（50年代）年代）说明：说明：未受精的卵子中的细胞质存在一些因子，

96、未受精的卵子中的细胞质存在一些因子，可以改变基因表达的模式，将已分化的细胞核转变为未分化的细胞可以改变基因表达的模式，将已分化的细胞核转变为未分化的细胞核核。这称为。这称为重编程重编程。（。（DNA序列未变化，但表观遗传上有变序列未变化，但表观遗传上有变化，包括化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质结构等）甲基化、组蛋白修饰、染色质结构等）以小鼠为对象重复青蛙的实验获得克隆小鼠以小鼠为对象重复青蛙的实验获得克隆小鼠说明：说明：哺乳动物的哺乳动物的未受精的卵子中也存在可进行重编程的因子未受精的卵子中也存在可进行重编程的因子后来发现：可对体细胞核进行重编程的不仅仅有卵子，后来发现：可对体细胞核进

97、行重编程的不仅仅有卵子，胚胎干细胞胚胎干细胞也具有也具有同样的功能（体细胞核移植到去核的胚胎干细胞中，也可使同样的功能（体细胞核移植到去核的胚胎干细胞中，也可使之胚胎发育成个体）之胚胎发育成个体）核移植技术核移植技术胚胎干细胞的体外培养（胚胎干细胞的体外培养（1980年：小鼠、年：小鼠、1998年：人类）年：人类）推断：体细胞进行核移植到去核的卵细胞或者胚胎干细胞中，均可使新细胞推断：体细胞进行核移植到去核的卵细胞或者胚胎干细胞中，均可使新细胞具有发育全能具有发育全能/多能，或者说卵细胞和胚胎干细胞中存在的特殊的因子，可使体细多能，或者说卵细胞和胚胎干细胞中存在的特殊的因子，可使体细胞转变为未

98、分化状态（如果将其应用于人体，在再生医学中将会有巨大的发展胞转变为未分化状态（如果将其应用于人体，在再生医学中将会有巨大的发展前景）前景）这就是干细胞研究中的一个热点：这就是干细胞研究中的一个热点：iPS细胞领域。细胞领域。第第3 3章章 细胞工程细胞工程1163.7.22006年：年：iPS在小鼠细胞上实现在小鼠细胞上实现500244个候选基因（与维持早期胚胎和个候选基因（与维持早期胚胎和胚胎干细胞同一性有关）胚胎干细胞同一性有关）4种基因种基因：Oct3/4、Sox2、c-Myc和和Klf4可以可以使来自胚胎小鼠或者成年小鼠的不同的纤维原使来自胚胎小鼠或者成年小鼠的不同的纤维原细胞保留胚胎

99、干细胞正常的多能性。细胞保留胚胎干细胞正常的多能性。 24个基因，个基因，反转录病毒载体反转录病毒载体，每个分别导入体，每个分别导入体细胞中培养细胞中培养无果无果全部导入全部导入可使体细胞转变为可使体细胞转变为iPS细胞细胞24个基因，个基因，1个个1个分别抽离个分别抽离确定确定10个个10个基因，个基因，1个个1个分别抽离个分别抽离最后确定最后确定4个个TakahashiK,YamanakaS.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell.200

100、6Aug25;126(4):663-76.胚胎或者成年小鼠分胚胎或者成年小鼠分化的成纤维细胞化的成纤维细胞Oct3/4，Sox2，c-Myc和和Klf4iPS细胞细胞第第3 3章章 细胞工程细胞工程117细胞多能性的初步鉴定：将细胞多能性的初步鉴定：将iPS细胞皮下注射裸鼠。细胞形细胞皮下注射裸鼠。细胞形成的畸胎瘤会有全部的三个胚层：外胚层、中胚层和内胚成的畸胎瘤会有全部的三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层。有这样的组织被认为是细胞多能性的可靠分析。结果，层。有这样的组织被认为是细胞多能性的可靠分析。结果，多数都表现出这样多能性。多数都表现出这样多能性。细胞多能性的最终鉴定：但将获得细胞多能性的

101、最终鉴定：但将获得的的iPS细胞注射到小鼠囊胚中，可细胞注射到小鼠囊胚中，可形成包含正常胚胎所有组织的嵌合形成包含正常胚胎所有组织的嵌合体。第体。第13天可发现具备天可发现具备iPS细胞发细胞发展而来的三个胚层组织的胚胎。但展而来的三个胚层组织的胚胎。但最终没有获得存活的嵌合体小鼠。最终没有获得存活的嵌合体小鼠。第第3 3章章 细胞工程细胞工程118Yamanaka的观点：的观点：c-Myc使全基因组广泛去甲基化以松使全基因组广泛去甲基化以松解染色质，使解染色质，使 oct3/4和和sox2接近到各自的转录调节位点接近到各自的转录调节位点发挥下游基因转录使细胞获得多能性，而发挥下游基因转录使细

102、胞获得多能性，而klf4则扮演了两个则扮演了两个角色，一方面作为角色，一方面作为oct4和和sox2的协同因子，另一方面发挥的协同因子，另一方面发挥抑制细胞凋亡的作用。抑制细胞凋亡的作用。 四种因子的作用示意图四种因子的作用示意图第第3 3章章 细胞工程细胞工程119iPS技术治疗病鼠技术治疗病鼠的路线图的路线图得镰刀型贫血症的小鼠，得镰刀型贫血症的小鼠，收集其皮肤细胞，体外收集其皮肤细胞，体外培养；培养；通过病毒的转导，将通过病毒的转导，将4个个外源基因导入其中；外源基因导入其中；皮肤细胞发生重编程，皮肤细胞发生重编程，变成变成iPS细胞；细胞；正常的正常的iPS细胞体外培养细胞体外培养成血

103、液干细胞；成血液干细胞；注射到患病小鼠中，获注射到患病小鼠中，获得恢复健康的正常小鼠得恢复健康的正常小鼠第第3 3章章 细胞工程细胞工程12007年年6月在月在nature和和cellstemcell上共发三篇上共发三篇iPS相关文相关文章，所得到的章，所得到的ips细胞在全能性和表观遗传上的表现和细胞在全能性和表观遗传上的表现和ES细胞相一致，且注射入囊胚后可以得到嵌合体小鼠细胞相一致，且注射入囊胚后可以得到嵌合体小鼠07年年8月和月和9月在月在nature和和cellstemcell上又发了两篇，上又发了两篇，是对前面工作的进一步修正是对前面工作的进一步修正1.OkitaK,Ichisak

104、aT,YamanakaS.Generationofgermline-competentinducedpluripotentstemcells.Nature.2007Jul19;448(7151):313-7.2.WernigM,MeissnerA,ForemanR,BrambrinkT,KuM,HochedlingerK,BernsteinBE,JaenischR.InvitroreprogrammingoffibroblastsintoapluripotentES-cell-likestate.Nature.2007Jul19;448(7151):318-24.3.DirectlyRepro

105、grammedFibroblastsShowGlobalEpigeneticRemodelingandWidespreadTissueContribution.CellStemCell,Vol1,55-70,07June20074.StrategiesandNewDevelopmentsintheGenerationofPatient-SpecificPluripotentStemCells.CellStemcell,Vol1,39-49,07June2007第第3 3章章 细胞工程细胞工程1213.7.32007年：年：iPS在人类细胞上实现在人类细胞上实现美国美国：JunyingYu（俞君

106、英）（俞君英）,etal.1InducedPluripotentStemCellLinesDerivedfromHumanSomaticCells.Science.20November2007日本：日本：Takahashietal.,InductionofPluripotentStemCellsfromAdultHumanFibroblastsbyDefinedFactors,Cell(2007),oi:10.1016/j.cell.2007.11.019Oct3/4、Sox2、c-Myc和和Klf4一位一位36岁妇女的表皮和一岁妇女的表皮和一位位69岁男性的结缔组织岁男性的结缔组织OCT4,

107、SOX2,NANOG,和和LIN28iPS细胞细胞日本日本美国美国胎儿皮肤细胞以及一个新生胎儿皮肤细胞以及一个新生儿的包皮细胞儿的包皮细胞 14个候选基因个候选基因反转录病毒反转录病毒载体载体第第3 3章章 细胞工程细胞工程12211月月19日日细胞细胞：日本京都大学的：日本京都大学的ShinyaYamanaka小组利用小组利用4种基因种基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和和Klf4将来自一位将来自一位36岁妇女的岁妇女的表皮细胞和一位表皮细胞和一位69岁男性的结缔组织重编程为岁男性的结缔组织重编程为iPS细胞。大约每细胞。大约每5000个细胞就能制造个细胞就能制造1个个iPS细胞系。细胞

108、系。 11月月20日日科学科学：美国威斯康辛大学：美国威斯康辛大学JamesThomson领导的领导的小组，从自己独自确定的小组，从自己独自确定的14种新的候选重组基因中，最终选择出种新的候选重组基因中，最终选择出4个基因个基因(OCT4,SOX2,NANOG,和和 LIN28），实现了在人体皮肤细），实现了在人体皮肤细胞内的基因重组，其中前两个基因与胞内的基因重组，其中前两个基因与Yamanaka小组相同。小组相同。山中伸弥山中伸弥第第3 3章章 细胞工程细胞工程123iPS技术的价值所在技术的价值所在突破一：实现了人类成熟体细胞的重编程为类似胚胎干细突破一：实现了人类成熟体细胞的重编程为类

109、似胚胎干细胞的多能干细胞胞的多能干细胞突破二：开辟了人类干细胞来源的新途径（人类之前的突破二：开辟了人类干细胞来源的新途径（人类之前的ES细胞研究，都需要人类卵细胞作为来源。细胞研究，都需要人类卵细胞作为来源。来源有限来源有限）突破三：成功绕开了卵细胞以及胚胎操作这些有关伦理的突破三：成功绕开了卵细胞以及胚胎操作这些有关伦理的障碍（人类之前的障碍（人类之前的ES细胞研究，要破坏胚胎。细胞研究，要破坏胚胎。受伦理谴受伦理谴责责。）。）突破四：采用基因工程的手段来研究细胞工程，提供了一突破四：采用基因工程的手段来研究细胞工程，提供了一种新的思路和方法，也是研究发育生物学、疾病发生发展种新的思路和方

110、法，也是研究发育生物学、疾病发生发展机制、基因与蛋白质功能分析等的十分重要的实用模型机制、基因与蛋白质功能分析等的十分重要的实用模型*第第3 3章章 细胞工程细胞工程124缺陷缺陷效率低下：效率低下：5K到到10K个细胞才能有一个个细胞才能有一个iPS细胞系细胞系载体的安全性：采用了稳定转化的病毒载体，病毒载体本身载体的安全性：采用了稳定转化的病毒载体，病毒载体本身的序列都有可能致瘤的序列都有可能致瘤候选基因的安全性：候选基因的安全性：c-myc是一种转录因子，也是一种可使是一种转录因子，也是一种可使细胞无限增殖，获永生化功能，促进细胞分裂的基因细胞无限增殖，获永生化功能，促进细胞分裂的基因，

111、与多与多种肿瘤发生发展有关种肿瘤发生发展有关 候选基因的范围：各自的候选基因的范围：各自的4个候选基因有两个重复，可见还个候选基因有两个重复，可见还可进一步缩小范围可进一步缩小范围重编程的分子机制：尚不清楚重编程的分子机制：尚不清楚不同基因诱导获得的不同基因诱导获得的iPS，再生出特定组织能力也有所不同，再生出特定组织能力也有所不同*第第3 3章章 细胞工程细胞工程1252008年：日本拟建年：日本拟建iPS细胞库细胞库山中伸弥山中伸弥5月月11日在京都举行的诱导多功能干细胞日在京都举行的诱导多功能干细胞（iPS细胞）国际研讨会上透露了日本建细胞）国际研讨会上透露了日本建iPS细胞库细胞库的计

112、划。日本规划中的细胞库将储存的计划。日本规划中的细胞库将储存iPS细胞以及细胞以及由其分化出来的各种脏器细胞。由其分化出来的各种脏器细胞。 http:/ 3章章 细胞工程细胞工程1262008年年9月月13日：日本京都大学日前宣布，该校教授山中日：日本京都大学日前宣布，该校教授山中伸弥开发的诱导多功能干细胞（伸弥开发的诱导多功能干细胞（iPS细胞）培养方法已被细胞）培养方法已被日本特许厅（相当于专利局）授予专利，成为世界首个获日本特许厅（相当于专利局）授予专利，成为世界首个获得批准的得批准的iPS细胞相关专利。细胞相关专利。获批的专利内容是获批的专利内容是“将种基因植入普通体细胞，可使体将种基

113、因植入普通体细胞，可使体细胞转变成拥有分化为各种组织细胞能力的细胞转变成拥有分化为各种组织细胞能力的iPS细胞细胞”，专利有效期到专利有效期到2026年年12月。月。京都大学希望通过在日本国内获得专利，造成既定事实，京都大学希望通过在日本国内获得专利，造成既定事实，从而在与欧美研究人员的竞争中抢得先机。从而在与欧美研究人员的竞争中抢得先机。这是世界首个这是世界首个iPS细胞相关专利，但鉴于人类细胞相关专利，但鉴于人类iPS细胞和实细胞和实验鼠验鼠iPS细胞的培养方法差别显著，在再生医疗领域备受细胞的培养方法差别显著，在再生医疗领域备受期待的人类期待的人类iPS细胞专利能否获得批准，前景尚不明朗

114、。细胞专利能否获得批准，前景尚不明朗。2008年：日本授予年：日本授予iPS技术专利技术专利http:/ 3章章 细胞工程细胞工程1272010年：欧洲首个年：欧洲首个iPS专利英国获批专利英国获批2010年年1月月12日英国知识产权办公室授予日英国知识产权办公室授予iPierian公司公司（2009年年7月月iZumiBio,Inc.与与Pierian,Inc.合并而成）合并而成）iPS技技术专利权，他们认为神户的一位科学家术专利权，他们认为神户的一位科学家KazuhiroSakurada才是才是iPS的创始人，山中伸弥不是，而的创始人，山中伸弥不是，而KazuhiroSakurada早期在

115、早期在iZumiBio,Inc.任首席科学家职务。早在任首席科学家职务。早在2008年年iPierian公司便对外宣称，他们该获得公司便对外宣称，他们该获得iPS的相关专的相关专利。利。山中伸弥曾在加州大学的一个实验室做山中伸弥曾在加州大学的一个实验室做iPS试验，试验的经试验，试验的经费来自费来自iPierian公司。公司。 http:/ 3章章 细胞工程细胞工程1283.7.4进展进展候选基因的变化候选基因的变化：3个基因（小鼠）；或者个基因（小鼠）；或者Oct4加上加上Klf4或或c-Myc（成年小鼠神经干细胞）；单个基因（成年小鼠神经干细胞）；单个基因Oct4(小鼠神经干小鼠神经干细胞

116、细胞)；microRNA和三种基因（和三种基因（miR-291-3p,miR-294，miR-295 和和Oct4,Sox2,Klf4）（鼠）、化学小分子（鼠）、化学小分子,细胞来源的拓展细胞来源的拓展：成熟：成熟B细胞（小鼠），老年细胞（小鼠），老年ALS患者皮肤（人患者皮肤（人类）；儿童类）；儿童SMA患者皮肤（人类），患者皮肤（人类），载体的改变载体的改变：药物：药物-慢病毒系统（人类），腺病毒载体（小鼠），慢病毒系统（人类），腺病毒载体（小鼠），转座子（人类），质粒（小鼠；人），无病毒载体转座子（人类），质粒（小鼠；人），无病毒载体诱导效率的提高诱导效率的提高：两种因子（人类）；阻断：

117、两种因子（人类）；阻断p53基因途径；低氧基因途径；低氧环境（人类）；环境（人类）；安全性研究安全性研究第第3 3章章 细胞工程细胞工程129进展进展1：去除：去除c-myc基因之后，剩下的基因之后，剩下的3个基因仍然能诱导出个基因仍然能诱导出iPS细胞细胞（山中伸弥，（山中伸弥，2008年年6月月14日，美国费城，国际干细胞研究协会会日，美国费城，国际干细胞研究协会会议议 ）三种不同类型的嵌合小鼠，都是由小鼠三种不同类型的嵌合小鼠，都是由小鼠 iPS细胞进一步得来的：第细胞进一步得来的：第一种类型的小鼠是在表皮细胞中导入四种转录子的基因副本一种类型的小鼠是在表皮细胞中导入四种转录子的基因副本

118、（Oct3/4，Sox2，c-Myc和和 Klf4）后得到的；第二类中没有导入）后得到的；第二类中没有导入可能导致肿瘤的可能导致肿瘤的c-Myc；第三类小鼠是利用源自肝和胃细胞的；第三类小鼠是利用源自肝和胃细胞的iPS育成的。育成的。结果：半数第一类小鼠发展出了肿瘤，大多数是甲状腺瘤。结果：半数第一类小鼠发展出了肿瘤，大多数是甲状腺瘤。136只只第二类小鼠中只有一只会产生肿瘤。不论是第一类还是第二类小鼠，第二类小鼠中只有一只会产生肿瘤。不论是第一类还是第二类小鼠，不论不论iPS源于纤维原细胞还是肝、胃细胞，只要重组的是成体细胞，源于纤维原细胞还是肝、胃细胞，只要重组的是成体细胞，小鼠的死亡率就

119、会急剧增加。小鼠的死亡率就会急剧增加。 源于胃和肝的源于胃和肝的iPS细胞的基因表达模式分析图谱说明，这些细胞的基因表达模式分析图谱说明，这些iPS细胞细胞并非彻底地拥有多能性，或许正是这种不完全的重组导致了小鼠死并非彻底地拥有多能性，或许正是这种不完全的重组导致了小鼠死亡。亡。 候选基因的变化候选基因的变化第第3 3章章 细胞工程细胞工程130进展进展2：单个基因单个基因就可诱导出就可诱导出iPS细胞细胞基因：基因：Oct4载体：反转录病毒载体载体：反转录病毒载体细胞来源：小鼠神经干细胞细胞来源：小鼠神经干细胞获得的获得的iPS细胞在体外可再培细胞在体外可再培养成神经干细胞，或者变成养成神经

120、干细胞，或者变成心肌细胞和生殖细胞心肌细胞和生殖细胞 JeongBeomKim,etal.Oct4-InducedPluripotencyinAdultNeuralStemCells.Cell,Volume136,Issue3,411-419,6February2009（马克斯（马克斯普郎克分普郎克分子生物医药研究所子生物医药研究所，德国波昂大学，德国波昂大学）第第3 3章章 细胞工程细胞工程131进展进展3：利用：利用4种重组蛋白诱导种重组蛋白诱导iPS细胞成功细胞成功美国美国Scripps研究所，研究所，ProteomTech公司，和德公司，和德国马克斯普朗克分子生物医学研究所等国马克斯普

121、朗克分子生物医学研究所等Cell Stem Cell, 23 April 2009 doi:10.1016/j.stem.2009.04.005GenerationofInducedPluripotentStemCellsUsingRecombinantProteins用四个转录因子的蛋白完成了由体细用四个转录因子的蛋白完成了由体细胞到诱导性干细胞的转变过程。自始胞到诱导性干细胞的转变过程。自始至终，细胞的遗传信息没有受到任何至终，细胞的遗传信息没有受到任何影响。影响。已经完成了体外和小鼠体内的实验，已经完成了体外和小鼠体内的实验，经过经过4个蛋白诱导的细胞具有完全的个蛋白诱导的细胞具有完全的

122、多能性。将这些多能性。将这些iPS细胞注入小鼠胚细胞注入小鼠胚胎中能形成嵌合小鼠，经过检查，小胎中能形成嵌合小鼠，经过检查，小鼠的体内有两种不同遗传背景的细胞鼠的体内有两种不同遗传背景的细胞系，这证实诱导胚胎细胞具有多能性。系，这证实诱导胚胎细胞具有多能性。 第第3 3章章 细胞工程细胞工程132蛋白诱导性干细胞的重大意义蛋白诱导性干细胞的重大意义1）安全性：转化过程没有使用病毒，没有使用基因，没有）安全性：转化过程没有使用病毒，没有使用基因，没有任何改变细胞遗传信息的风险；任何改变细胞遗传信息的风险；2）普及性：蛋白诱导方法远比基因诱导方法简单易行。这）普及性：蛋白诱导方法远比基因诱导方法简

123、单易行。这样一来，样一来，iPS技术不再被几个资深实验室所垄断。大部分实技术不再被几个资深实验室所垄断。大部分实验室都可以重复蛋白方法而获得验室都可以重复蛋白方法而获得iPS。也就是说，蛋白诱导。也就是说，蛋白诱导方法大大降低了方法大大降低了iPS领域的领域的“门坎门坎”。3）可行性：由于该方法的简单易行，重复性强，它可以被）可行性：由于该方法的简单易行，重复性强，它可以被扩大化，产业化，进而被商业化。扩大化，产业化，进而被商业化。 http:/ 3章章 细胞工程细胞工程133进展进展4：化学小分子化学小分子可替代基因诱导可替代基因诱导iPS细胞细胞哈佛大学干细胞研究所哈佛大学干细胞研究所(H

124、SCI)利用一种小分子化学物质利用一种小分子化学物质RepSox代替了其中的代替了其中的Sox2和和 cMyc基因的功能，并且基因的功能，并且RepSox是在该实验的不同时间以不是在该实验的不同时间以不同的形式发挥功能。由于同的形式发挥功能。由于cMyc是肿瘤促进因子是肿瘤促进因子(tumorpromoter)，利用，利用 cMyc产生的产生的iPS细胞不能用于人类疾细胞不能用于人类疾病治疗，因此十分有必要寻找一种不使用病治疗，因此十分有必要寻找一种不使用cMyc基因的产生基因的产生iPS细胞新方法。细胞新方法。 CellStemCell,08October2009doi:10.1016/j.

125、stem.2009.09.012ASmall-MoleculeInhibitorofTgf-SignalingReplacesSox2inReprogrammingbyInducingNanog第第3 3章章 细胞工程细胞工程134进展进展1：成熟成熟B细胞细胞可重编程为可重编程为iPS细胞细胞 成纤维细胞：一种特殊类型的能分化成其他类型的皮肤细胞。成纤维细胞：一种特殊类型的能分化成其他类型的皮肤细胞。由于无法分辨这些成纤维细胞是否已完全分化，先前实验中由于无法分辨这些成纤维细胞是否已完全分化，先前实验中使用的细胞也许分化得比较少，因此更容易转化为如同胚胎使用的细胞也许分化得比较少，因此更容易

126、转化为如同胚胎干细胞状态的干细胞状态的iPS细胞。而成熟细胞。而成熟B细胞的细胞的DNA有特定的一部分有特定的一部分在最终成熟阶段会被剔除在最终成熟阶段会被剔除 。细胞来源：小鼠成熟和非成熟细胞来源：小鼠成熟和非成熟B细胞细胞病毒载体：反转录病毒病毒载体：反转录病毒基因：基因：Oct4、Sox2、c-Myc与与Klf4来自成熟与非成熟来自成熟与非成熟B细胞的细胞的iPS细胞能用来制造老鼠。这些来细胞能用来制造老鼠。这些来自重组成熟自重组成熟B细胞的老鼠，同成熟细胞的老鼠，同成熟B细胞一样缺失了相同部分细胞一样缺失了相同部分的的DNA，这证明已成功地重组了已完全分化的细胞。，这证明已成功地重组了

127、已完全分化的细胞。JacobHanna,etal.DirectReprogrammingofTerminallyDifferentiatedMatureBLymphocytestoPluripotency.Cell,Vol133,250-264,18April2008(美国怀特黑德生物医学美国怀特黑德生物医学研究所鲁道夫研究所鲁道夫詹尼士实验室詹尼士实验室 )细胞来源的拓展细胞来源的拓展第第3 3章章 细胞工程细胞工程135进展进展2：用：用老年老年ALS患者皮肤患者皮肤制造制造iPS细胞细胞基因：同样的四个基因基因：同样的四个基因细胞来源：细胞来源：2位罹患肌萎缩性脊髓侧索硬化症位罹患肌萎缩

128、性脊髓侧索硬化症（ALS）这种神经退行性病变的老年病人的皮肤）这种神经退行性病变的老年病人的皮肤应用：用这些应用：用这些iPS细胞培养出看来像是健康的运细胞培养出看来像是健康的运动神经元细胞。动神经元细胞。 JohnT.Dimos,etal.InducedPluripotentStemCellsGeneratedfromPatientswithALSCanBeDifferentiatedintoMotorNeurons.Science，DOI:10.1126/science.1158799（哈佛，凯文哈佛，凯文艾根艾根 ）第第3 3章章 细胞工程细胞工程136进展进展3：从：从成熟恒河猴成纤维

129、细胞成熟恒河猴成纤维细胞中获得中获得iPS细胞细胞细胞来源：恒河猴成纤维细胞细胞来源：恒河猴成纤维细胞基因：基因：OCT4,SOX2,KLF4和和 c-MYC载体：反转录病毒载体载体：反转录病毒载体LiuH,etal. GenerationofInducedPluripotentStemCellsfromAdultRhesusMonkeyFibroblasts.CellStemCell.2008Dec4;3(6):587-90 （北大，邓宏魁）（北大，邓宏魁）第第3 3章章 细胞工程细胞工程137进展进展1：仅仅两个内生因子（：仅仅两个内生因子（Oct4加上加上Klf4或或c-Myc），就足以

130、），就足以从从成年小鼠神经干细胞成年小鼠神经干细胞生成生成iPS细胞细胞细胞来源：小鼠神经干细胞细胞来源：小鼠神经干细胞基因：基因： Oct4加上加上Klf4或或c-Myc载体：反转录病毒载体载体：反转录病毒载体可能是因为这些神经细胞比胚胎干细胞表可能是因为这些神经细胞比胚胎干细胞表达更高水平的内生达更高水平的内生Sox2和和 c-Myc，这说，这说明具有适当匹配的转录因子的体细胞是生明具有适当匹配的转录因子的体细胞是生成成iPS细胞的一个潜在有用的起始点细胞的一个潜在有用的起始点 JeongBeomKim,etal.Pluripotentstemcellsinducedfromadultne

131、uralstemcellsbyreprogrammingwithtwofactors.Nature454,646-650(24July2008)|doi:10.1038/nature07061(德国马克斯德国马克斯普朗克分子生物医学研究院细胞与发育生物学系和普朗克分子生物医学研究院细胞与发育生物学系和德国亚琛工业大学医学院德国亚琛工业大学医学院)诱导效率的提高诱导效率的提高第第3 3章章 细胞工程细胞工程138进展进展2：两种因子可提高：两种因子可提高iPS转化率转化率细胞细胞来源来源：人成纤维细胞人成纤维细胞两种因子：两种因子：p53siRNA和和UTF1基因：基因：OCT4,SOX2,KL

132、F4和和c-MYC（如果没有（如果没有c-MYC（具有致（具有致癌性基因），也同样可以成功诱癌性基因），也同样可以成功诱导人类的导人类的iPS）YangZhao,et al. TwoSupportingFactorsGreatlyImprovetheEfficiencyofHumaniPSCGeneration.Cell Stem Cell,Volume3,Issue5,6November2008doi:10.1016/j.stem.2008.10.002（北大，邓宏魁）（北大，邓宏魁）第第3 3章章 细胞工程细胞工程139进展进展3：综述：高效诱导：综述：高效诱导iPS的方法模型的方法模型S

133、hinyaYamanaka集中介绍了集中介绍了iPS的生成机制以及它的生成过程效率的生成机制以及它的生成过程效率低、速度慢的原因。他最后提出了低、速度慢的原因。他最后提出了一个进行直接重新编程的模型，按一个进行直接重新编程的模型，按照该模型，所有或大多数细胞都有照该模型，所有或大多数细胞都有可能变成多能细胞。可能变成多能细胞。Nature 49-52 (2 July 2009) doi:10.1038/nature08180Eliteandstochasticmodelsforinducedpluripotentstemcellgeneration 第第3 3章章 细胞工程细胞工程140进展进

134、展4：通过阻断：通过阻断p53基因路径可以将基因路径可以将iPS转化的成转化的成功率提高约百倍功率提高约百倍来自不同国家的来自不同国家的5个科研小组同时报告了相关进展个科研小组同时报告了相关进展通过阻断一个名为通过阻断一个名为“p53”的基因的路径，可以将皮肤细胞的基因的路径，可以将皮肤细胞转化为转化为iPS细胞的成功率提高至细胞的成功率提高至10左右，是原有转化率左右，是原有转化率的大约百倍，同时能更好地兼顾效率和安全。的大约百倍，同时能更好地兼顾效率和安全。 Nature advance online publication 9 August 2009 | doi:10.1038/natu

135、re08235 Suppressionofinducedpluripotentstemcellgenerationbythep53p21pathway 第第3 3章章 细胞工程细胞工程141进展进展5：低氧环境可提高培养：低氧环境可提高培养iPS细胞效率细胞效率 日本京都大学日本京都大学Cell Stem Cell, 27 August 2009 doi:10.1016/j.stem.2009.08.001 HypoxiaEnhancestheGenerationofInducedPluripotentStemCells 在利用人体皮肤细胞培养在利用人体皮肤细胞培养iPS细胞时把培养环境的氧浓

136、度从细胞时把培养环境的氧浓度从通常的通常的21降到降到5，发现，发现iPS细胞的生成效率可提高到原来细胞的生成效率可提高到原来的的25倍至倍至42倍。但如果进一步降低氧浓度到倍。但如果进一步降低氧浓度到1，就会，就会适得其反导致部分细胞死亡。研究人员又利用实验鼠的皮肤适得其反导致部分细胞死亡。研究人员又利用实验鼠的皮肤细胞培养细胞培养iPS细胞，发现细胞，发现5的氧浓度也是最合适的。的氧浓度也是最合适的。第第3 3章章 细胞工程细胞工程142进展进展6：脂肪干细胞更易转变为：脂肪干细胞更易转变为iPS细胞细胞美国斯坦福大学美国斯坦福大学在脂肪干细胞和皮肤成纤维细胞中分别加入能够编码在脂肪干细胞

137、和皮肤成纤维细胞中分别加入能够编码4种种转录因子的基因后，约有万分之一的皮肤成纤维细胞转变转录因子的基因后，约有万分之一的皮肤成纤维细胞转变为为iPS细胞，而转变为细胞，而转变为iPS细胞的脂肪干细胞比例达到千分细胞的脂肪干细胞比例达到千分之二，是前者的之二，是前者的20倍。倍。 利用脂肪干细胞培养利用脂肪干细胞培养iPS细胞不需要饲养细胞，这无疑提细胞不需要饲养细胞，这无疑提高了其安全性。高了其安全性。 PNAS September 8, 2009, doi: 10.1073/pnas.0908450106 Feeder-freederivationofinducedpluripotents

138、temcellsfromadulthumanadiposestemcells 第第3 3章章 细胞工程细胞工程143进展1：药物药物-慢病毒载体慢病毒载体载体：慢病毒载体载体：慢病毒载体只需要用药物只需要用药物-慢病毒系统就能产生慢病毒系统就能产生iPS细细胞，制备的胞，制备的iPS从结构和功能上都与人类胚从结构和功能上都与人类胚胎干细胞很相似。这种方法的独特之处是胎干细胞很相似。这种方法的独特之处是用用doxycycline(多西环素多西环素)来控制转录因子来控制转录因子的表达。的表达。 NimetMaherali,etal.AHigh-EfficiencySystemfortheGener

139、ationandStudyofHumanInducedPluripotentStemCells.CellStemCell,Vol3,340-345,11September2008DirkHockemeyer,etal.ADrug-InducibleSystemforDirectReprogrammingofHumanSomaticCellstoPluripotency.CellStemCell,Vol3,346-353,11September2008(哈佛大学干细胞研究所哈佛大学干细胞研究所 )载体的改变载体的改变第第3 3章章 细胞工程细胞工程144进展进展2：采用非整合性载体：采用非整合性

140、载体腺病毒载体腺病毒载体基因：基因：Oct4,Sox2,Klf4,andc-Myc载体：非整合型的腺病毒载载体：非整合型的腺病毒载体体细胞来源：小鼠纤维原细胞细胞来源：小鼠纤维原细胞和肝脏细胞和肝脏细胞MatthiasStadtfeld,MasakiNagaya,JochenUtikal,GordonWeir,andKonradHochedlinger. InducedPluripotentStemCellsGeneratedWithoutViralIntegration.Science7November2008:945-949.(哈佛，康拉德哈佛，康拉德霍克林格霍克林格 )第第3 3章章 细

141、胞工程细胞工程145进展进展3：采用：采用质粒载体质粒载体细胞来源：鼠胚胎成纤维细胞细胞来源：鼠胚胎成纤维细胞 载体：质粒载体：质粒基因：基因：c-Myc（质粒（质粒1）；）；Oct34、Klf4和和Sox2（质粒（质粒2）用这种方法培养的用这种方法培养的iPS细胞与以往的细胞与以往的iPS细胞一样能分化生成表皮、横纹细胞一样能分化生成表皮、横纹肌和神经组织等多种细胞，但转化效肌和神经组织等多种细胞，但转化效率比用逆转录酶病毒为载体要低一些。率比用逆转录酶病毒为载体要低一些。 KeisukeOkita,MasatoNakagawa,HongHyenjong,TomokoIchisaka,and

142、ShinyaYamanaka.GenerationofMouseInducedPluripotentStemCellsWithoutViralVectors.Science7November2008:949-953.（日本京都大学，（日本京都大学，山中伸弥）山中伸弥）第第3 3章章 细胞工程细胞工程146进展进展4：采用：采用转座子转座子进行转导，可获得进行转导，可获得无载体和转无载体和转基因基因的的iPS细胞细胞细胞来源：人类胎儿的纤维母细胞细胞来源：人类胎儿的纤维母细胞基因：基因：c-Myc,Klf4,Oct4和和 Sox2载体：载体： piggyBac转座子转座子优点：提高了安全性，不易

143、使基因癌优点：提高了安全性，不易使基因癌化；且能通过转座子的切除来获得无化；且能通过转座子的切除来获得无载体和转基因的载体和转基因的iPS细胞细胞Virus-freeinductionofpluripotencyandsubsequentexcisionofreprogrammingfactors.Nature，doi:10.1038/nature07864，KeisukeKaji，KnutWoltjenpiggyBactranspositionreprogramsfibroblaststoinducedpluripotentstemcells.Nature，doi:10.1038/natur

144、e07863，KnutWoltjen，AndrasNagy（英国（英国爱丁堡大学教授木尾圭介（爱丁堡大学教授木尾圭介（KeisukeKaji）和加拿大的研究小组）和加拿大的研究小组 ）第第3 3章章 细胞工程细胞工程147进展进展5：采用：采用质粒质粒进行转导获得的进行转导获得的iPS细胞细胞不含任不含任何外源何外源DNA细胞来源：人包皮细胞细胞来源：人包皮细胞 载体：质粒载体：质粒在质粒中的基因所表达的蛋白质会将细胞重新在质粒中的基因所表达的蛋白质会将细胞重新编程并使其成为编程并使其成为iPS细胞。细胞。 这些这些iPS细胞在接细胞在接着的几轮细胞分裂中会开始失去这些质粒，这着的几轮细胞分裂

145、中会开始失去这些质粒，这样研究人员就可以分离出不含质粒的细胞。样研究人员就可以分离出不含质粒的细胞。优点：优点：iPS细胞中不再留存有任何外源的细胞中不再留存有任何外源的DNAJunyingYu（俞君英）（俞君英）,etal. HumanInducedPluripotentStemCellsFreeofVectorandTransgeneSequences.ScienceMarch26,2009DOI:10.1126/science.1172482（威斯康辛大学）（威斯康辛大学）第第3 3章章 细胞工程细胞工程148进展进展6：成功移除：成功移除iPS细胞中的致癌基因细胞中的致癌基因载体载体：

146、Cre-recombinaseexcisableviruses细胞来源：帕金森氏症患者细胞来源：帕金森氏症患者优点：利用优点：利用Cre/LoxP重组去除整合的转基重组去除整合的转基因因缺点：还是会将载体序列遗留下来缺点：还是会将载体序列遗留下来FrankSoldner,etal. ParkinsonsDiseasePatient-DerivedInducedPluripotentStemCellsFreeofViralReprogrammingFactors.Cell,6March2009doi:10.1016/j.cell.2009.02.013（美国白头生物医学研究所等（美国白头生物医学

147、研究所等 ）第第3 3章章 细胞工程细胞工程149进展进展7：不使用病毒载体不使用病毒载体生成人生成人iPS细胞系的方法细胞系的方法这项工作成功地在没有使用病毒载体的这项工作成功地在没有使用病毒载体的情况下使人体细胞产生了多能性。情况下使人体细胞产生了多能性。 利用来自病毒的利用来自病毒的2A肽序列生成一种结合肽序列生成一种结合重新编程因子的重新编程因子的“多顺反子载体多顺反子载体”（multicistronicvector），该载体被），该载体被piggyBac转位子载体送入细胞中，从而转位子载体送入细胞中，从而在人及小鼠成纤维细胞中都生成了稳定在人及小鼠成纤维细胞中都生成了稳定的的iPS细

148、胞。然后，与细胞。然后，与2A结合在一起的重结合在一起的重新编程因子（在已经生成的新编程因子（在已经生成的iPS细胞系中细胞系中是不需要的）被除去。是不需要的）被除去。Nature 458, 766-770 (9 April 2009) | doi:10.1038/nature07863piggyBactranspositionreprogramsfibroblaststoinducedpluripotentstemcells第第3 3章章 细胞工程细胞工程150进展进展8：三种：三种microRNA和三种基因的联合使用可促使和三种基因的联合使用可促使小鼠皮肤细胞转化为小鼠皮肤细胞转化为iPS

149、细胞细胞Oct4,Sox2andKlf4这这三种基因三种基因采用采用反转录病毒载体反转录病毒载体microRNA（miR-291-3p,miR-294和和miR-295）采用）采用脂质脂质体载体体载体同样可使小鼠皮肤细胞转化为同样可使小鼠皮肤细胞转化为iPS细胞细胞优点：取代其中的可能致癌的因子（优点：取代其中的可能致癌的因子（c-myc）RobertLJudson,etal.NatureBiotechnology12April2009doi:10.1038/nbt.1535.EmbryonicstemcellspecificmicroRNAspromoteinducedpluripotenc

150、y(美国加利福尼亚大学旧金山分校美国加利福尼亚大学旧金山分校 )第第3 3章章 细胞工程细胞工程151不同体细胞培育出的不同体细胞培育出的iPS细胞安全性细胞安全性存差异存差异分别利用小鼠胚胎的皮肤细胞、成年小鼠的胃细胞、尾巴分别利用小鼠胚胎的皮肤细胞、成年小鼠的胃细胞、尾巴的皮肤细胞以及肝脏细胞培育的皮肤细胞以及肝脏细胞培育iPS细胞。利用不同的体细胞细胞。利用不同的体细胞和培育方法，研究人员共培育出和培育方法，研究人员共培育出36种种iPS细胞。细胞。 使这使这36种种iPS细胞都分化成具备演变成神经能力的细胞，并细胞都分化成具备演变成神经能力的细胞，并把这些细胞植入另一些实验鼠的大脑。结

151、果显示，被植入把这些细胞植入另一些实验鼠的大脑。结果显示，被植入分化细胞来自成年小鼠尾巴皮肤细胞的实验鼠中有分化细胞来自成年小鼠尾巴皮肤细胞的实验鼠中有83体体内出现了肿瘤；被植入分化细胞来自于小鼠胚胎皮肤细胞内出现了肿瘤；被植入分化细胞来自于小鼠胚胎皮肤细胞的实验鼠中只有的实验鼠中只有8出现肿瘤；而如果实验鼠移植的分化细出现肿瘤；而如果实验鼠移植的分化细胞来自成年小鼠的胃细胞，其体内没有出现肿瘤。胞来自成年小鼠的胃细胞，其体内没有出现肿瘤。 利用含有癌症基因的体细胞培育利用含有癌症基因的体细胞培育iPS，对肿瘤的发生几率并，对肿瘤的发生几率并无显著影响。无显著影响。 iPSiPS细胞安全性研

152、究细胞安全性研究Nature Biotechnology 9 July 2009 | doi:10.1038/nbt.1554Variationinthesafetyofinducedpluripotentstemcelllines第第3 3章章 细胞工程细胞工程152国内研究进展国内研究进展机构：中科院广州生物医药与健康研究院机构：中科院广州生物医药与健康研究院华南干细胞与再生医学研究所，华南干细胞与再生医学研究所，裴端卿裴端卿载体：反转录病毒载体载体：反转录病毒载体基因：基因：Oct4，Sox2，Myc，和，和KLF4细胞来源：未经遗传修改的细胞来源：未经遗传修改的小鼠小鼠成纤维细成纤维细

153、胞胞时间：时间：2007，11DajiangQin,WenLi,JinZhangandDuanqingPei.DirectgenerationofES-likecellsfromunmodifiedmouseembryonicfibroblastsbyOct4/Sox2/Myc/Klf4.CellResearch(2007)17:959962.doi:10.1038/cr.2007.92;publishedonline6November2007第第3 3章章 细胞工程细胞工程153进展进展1：小鼠脑膜细胞小鼠脑膜细胞可诱导为可诱导为iPS机构：中国科学院广州生物医药与健康研机构：中国科学院广州

154、生物医药与健康研究院干细胞与再生医学研究所，究院干细胞与再生医学研究所，裴端卿裴端卿细胞来源：细胞来源：小鼠脑膜（小鼠脑膜（meningeal）细胞）细胞重要的胚胎干细胞调控因子之一重要的胚胎干细胞调控因子之一Sox2的表达含量在这种细胞中非常高，而且这的表达含量在这种细胞中非常高，而且这种细胞易于诱导为种细胞易于诱导为iPS细胞。由细胞。由DNA甲基甲基化分析得知，由脑膜细胞形成的化分析得知，由脑膜细胞形成的iPS克隆克隆不需要经过筛选就能够发生完全的重编程，不需要经过筛选就能够发生完全的重编程，而且这些克隆能够而且这些克隆能够100%产生嵌合小鼠。产生嵌合小鼠。时间：时间：2008，10A

155、romaticResiduesintheC-terminalDomain2AreRequiredforNanogtoMediateLIF-independentSelf-renewalofMouseEmbryonicStemCells.J.Biol.Chem，doi:10.1074/jbc.M706009200，ZheWang，DuanqingPei第第3 3章章 细胞工程细胞工程154进展进展2：两种因子可提高：两种因子可提高iPS转化率转化率机构：北大，机构：北大，邓宏魁邓宏魁细胞来源：人成纤维细胞细胞来源：人成纤维细胞两种因子：两种因子：p53siRNA和和UTF1基因：基因：OCT4,

156、SOX2,KLF4和和c-MYC（如果没有（如果没有c-MYC（具有致癌性基因）（具有致癌性基因），也同样可以成功诱导人类的，也同样可以成功诱导人类的iPS）时间：时间：2008，11YangZhao,etal. TwoSupportingFactorsGreatlyImprovetheEfficiencyofHumaniPSCGeneration.CellStemCell,6November2008,3(5)pp.475-479 第第3 3章章 细胞工程细胞工程155进展进展3：从：从成熟恒河猴成纤维细胞成熟恒河猴成纤维细胞中获得中获得iPS细胞细胞机构：北大，机构：北大，邓宏魁邓宏魁细胞来

157、源：细胞来源：恒河猴恒河猴成纤维细胞成纤维细胞基因：基因：OCT4,SOX2,KLF4和和 c-MYC载体：反转录病毒载体载体：反转录病毒载体时间：时间：2008，12LiuH,etal. GenerationofInducedPluripotentStemCellsfromAdultRhesusMonkeyFibroblasts.CellStemCell.2008Dec4;3(6):587-90第第3 3章章 细胞工程细胞工程156进展进展4：大鼠体细胞大鼠体细胞转化为转化为iPS细胞细胞机构：中国科学院上海生化所，机构：中国科学院上海生化所，肖磊肖磊研究组研究组病毒表达转录因子把大鼠成体细

158、胞成功地重病毒表达转录因子把大鼠成体细胞成功地重编程到多能干细胞状态。编程到多能干细胞状态。从数百个形态类似胚胎干细胞的细胞克隆中，从数百个形态类似胚胎干细胞的细胞克隆中，建立了建立了22个类似胚胎干细胞的细胞系。经过个类似胚胎干细胞的细胞系。经过进一步筛选、鉴定，最终获得两株符合多能进一步筛选、鉴定，最终获得两株符合多能干细胞标准的干细胞标准的大鼠大鼠iPS细胞系细胞系。时间：时间：2009，1JingLiao.GenerationofInducedPluripotentStemCellLinesfromAdultRatCells.CellStemCell,Volume4,Issue1,9J

159、anuary2009,Pages11-15第第3 3章章 细胞工程细胞工程157进展进展5：维生素维生素C可提高可提高iPS细胞诱导效率细胞诱导效率机构：中科院广州生物医药与健康研究机构：中科院广州生物医药与健康研究院，院，裴端卿裴端卿在培养过程中添加维生素在培养过程中添加维生素C可使可使iPS诱导诱导效率提高效率提高10倍。通过老鼠和人细胞实验倍。通过老鼠和人细胞实验发现，培养时添加维生素发现，培养时添加维生素C可促进相关可促进相关基因表达，推动体细胞进入重编程状态。基因表达，推动体细胞进入重编程状态。时间：时间：2009，12CellStemCell, 24 December 2009 d

160、oi:10.1016/j.stem.2009.12.001Vitamin C Enhances the Generation of Mouse and Human Induced Pluripotent Stem Cells 第第3 3章章 细胞工程细胞工程158进展进展6：成功构建：成功构建小型藏香猪小型藏香猪iPS细胞系细胞系机构：中国科学院广州生物医药与健机构：中国科学院广州生物医药与健康研究院康研究院 裴端卿裴端卿通过改进现有的通过改进现有的iPS技术，成功的利用技术，成功的利用一种小型藏香猪（其体型小巧，便于一种小型藏香猪（其体型小巧，便于饲养和维护）构建出了干细胞系。饲养和维护）构

161、建出了干细胞系。 JBC doi:10.1074/jbc.M109.008938 on April 17, 2009 Generationofinducedpluripotentstemcelllinesfromtibetanminiaturepig 第第3 3章章 细胞工程细胞工程159进展进展7：培育出首株：培育出首株猪源猪源iPS细胞系细胞系机构：上海生物化学与细胞生物学研究所机构：上海生物化学与细胞生物学研究所 肖磊肖磊通过使用转录因子重编程了来自一头猪的通过使用转录因子重编程了来自一头猪的耳朵和骨髓的细胞，从而成功地培育出了耳朵和骨髓的细胞，从而成功地培育出了诱导多能干细胞。诱导多能

162、干细胞。这是全世界首次使用有蹄类动物的体细胞这是全世界首次使用有蹄类动物的体细胞（不是精细胞或卵细胞）实现了这一成果（不是精细胞或卵细胞）实现了这一成果 Journal of Molecular Cell Biology,doi:10.1093/jmcb/mjp003GenerationofPig-InducedPluripotentStemCellswithaDrug-InducibleSystem第第3 3章章 细胞工程细胞工程1603.7.5iPS细胞的应用细胞的应用基因：基因：Ngn3、Pdx1和和Mafa载体：腺病毒载体：腺病毒 患糖尿病的小鼠：胰腺内大约患糖尿病的小鼠：胰腺内大约2

163、0%的外分泌细胞转化成胰岛的外分泌细胞转化成胰岛细胞细胞 胰岛胰岛细胞数量稀少，一旦遭破坏，细胞数量稀少，一旦遭破坏，就会引发就会引发I型糖尿病。外分泌细胞较型糖尿病。外分泌细胞较常见，在胰腺中大约占常见，在胰腺中大约占95%。 Invivoreprogrammingofadultpancreaticexocrinecellstocells.Nature455,627-632(2October2008)|doi:10.1038/nature07314;Received26June2008;Accepted6August2008;Publishedonline27August2008（美国哈佛大

164、学医学院，（美国哈佛大学医学院，道格拉斯道格拉斯梅尔顿和波士顿儿童医院）梅尔顿和波士顿儿童医院）应用应用1：利用重编程技术实现不同种成体细胞间直接转化：利用重编程技术实现不同种成体细胞间直接转化第第3 3章章 细胞工程细胞工程161应用应用2：世界首例使用患者：世界首例使用患者iPS细胞重现病细胞重现病症的成功尝试症的成功尝试细胞来源：重症神经疾病（细胞来源：重症神经疾病（Spinalmuscularatrophy，SMA，脊椎肌肉萎缩症）患者的皮肤细胞，脊椎肌肉萎缩症）患者的皮肤细胞将这些将这些iPS细胞培育为神经细胞后，在试管内成功再细胞培育为神经细胞后，在试管内成功再现了神经细胞因疾病死

165、亡的过程。用现了神经细胞因疾病死亡的过程。用iPS细胞可无限细胞可无限度繁殖病变细胞用于研究，此意义实属非凡。度繁殖病变细胞用于研究，此意义实属非凡。 AllisonD.,etal.Ebert Inducedpluripotentstemcellsfromaspinalmuscularatrophypatient.Natureadvanceonlinepublication21December2008|doi:10.1038/nature07677（美国威斯康辛大学，詹姆斯（美国威斯康辛大学，詹姆斯汤姆森的科研小组，俞君英汤姆森的科研小组，俞君英第二作者第二作者 ）SMA：一种遗传疾病，会攻击

166、脊髓中的运动神经细胞。人体内缺乏：一种遗传疾病，会攻击脊髓中的运动神经细胞。人体内缺乏SMN蛋白（蛋白（SMN蛋白是运动神经元生存蛋白，能够使肌肉活动）时会引发该疾病。蛋白是运动神经元生存蛋白，能够使肌肉活动）时会引发该疾病。患有该疾病的婴儿出生患有该疾病的婴儿出生6个月后，该疾病就会慢慢发展，接着肌肉出现萎缩，无法控个月后，该疾病就会慢慢发展，接着肌肉出现萎缩，无法控制运动，直至完全瘫痪，制运动，直至完全瘫痪，2岁左右就会死亡。岁左右就会死亡。第第3 3章章 细胞工程细胞工程162应用应用3：SMA儿童皮肤细胞诱导出儿童皮肤细胞诱导出iPS细胞，细胞，用于神经细胞的培养以研究疾病病理用于神经

167、细胞的培养以研究疾病病理细胞来源：患有脊髓性肌萎缩症（细胞来源：患有脊髓性肌萎缩症（SMA）儿童的皮）儿童的皮肤细胞肤细胞利用这些利用这些iPS细胞培育出包含导致细胞培育出包含导致SMA疾病遗传缺疾病遗传缺陷的运动神经细胞，以观察该疾病怎样发展，并试陷的运动神经细胞，以观察该疾病怎样发展，并试图找到治疗该疾病的方法。图找到治疗该疾病的方法。 Inducedpluripotentstemcellsfromaspinalmuscularatrophypatient.Nature，doi:10.1038/nature07677，AllisonD.Ebert，CliveN.SvendsenInduce

168、dpluripotentstemcellsfromaspinalmuscularatrophypatient.Nature457,277-280(15January2009)|doi:10.1038/nature07677（威斯康辛大学麦迪逊分校，克利夫（威斯康辛大学麦迪逊分校，克利夫斯斯万森实验室万森实验室 ）第第3 3章章 细胞工程细胞工程163应用应用4：iPS细胞可在胚胎中正常发育细胞可在胚胎中正常发育中国北京生命科学研究所的中国北京生命科学研究所的高绍荣高绍荣博士等博士等使用了现有方法重编程了小鼠细胞，从而分离出了使用了现有方法重编程了小鼠细胞，从而分离出了5个新个新的的iPSC系。

169、然后他们发现，利用其中一个细胞系，他们系。然后他们发现，利用其中一个细胞系，他们能够培育出存活到出生的四倍体互补胚胎，而且一个胚胎能够培育出存活到出生的四倍体互补胚胎，而且一个胚胎还存活到了成年。还存活到了成年。暗示暗示iPS细胞与细胞与细胞全能性细胞全能性有关有关 Cell Stem Cell, 23 July 2009 doi:10.1016/j.stem.2009.07.001iPSCellsCanSupportFull-TermDevelopmentofTetraploidBlastocyst-ComplementedEmbryos第第3 3章章 细胞工程细胞工程164应用应用5：iP

170、S细胞注射入囊胚培育出健康小鼠细胞注射入囊胚培育出健康小鼠中国科学院动物研究所中国科学院动物研究所周琪周琪和上海交通大学医学院和上海交通大学医学院曾凡一曾凡一Nature advance online publication 23 July 2009 | doi:10.1038/nature08267iPScellsproduceviablemicethroughtetraploidcomplementationnear-finalversion 制备了制备了37株株iPS细胞，利用其中细胞，利用其中6株株iPS细胞系注射了细胞系注射了1500多个四倍体囊胚，最多个四倍体囊胚，最终终3株株iP

171、S细胞系获得了共计细胞系获得了共计27个活体小个活体小鼠，经多种分子生物学技术鉴定，证实鼠，经多种分子生物学技术鉴定，证实该小鼠确实从该小鼠确实从iPS细胞发育而成，有些细胞发育而成，有些小鼠现已发育成熟并且繁殖了后代，这小鼠现已发育成熟并且繁殖了后代，这是世界上第一次获得完全由是世界上第一次获得完全由iPS细胞制细胞制备的活体小鼠，有力地备的活体小鼠，有力地证明了证明了iPS细胞细胞具有真正的全能性。具有真正的全能性。第第3 3章章 细胞工程细胞工程165应用应用6：用：用iPS细胞育出鼠听神经祖细胞细胞育出鼠听神经祖细胞日本京都大学，伊藤寿一和山中伸弥日本京都大学，伊藤寿一和山中伸弥利用老

172、鼠皮肤细胞制造的利用老鼠皮肤细胞制造的iPS细胞进行培养，得到了听神经细胞进行培养，得到了听神经祖细胞，然后将听神经祖细胞移植入一只新生幼鼠的内耳耳祖细胞，然后将听神经祖细胞移植入一只新生幼鼠的内耳耳蜗。一个月以后，移植的多数细胞不断发育成熟，进而构成蜗。一个月以后，移植的多数细胞不断发育成熟，进而构成了螺旋神经节。而螺旋神经节了螺旋神经节。而螺旋神经节这种听神经的减少或消失这种听神经的减少或消失会导致听力障碍。会导致听力障碍。 上述成果有助于治疗因听神经数量减少导致听力障碍的患者。上述成果有助于治疗因听神经数量减少导致听力障碍的患者。 NeuroReport 23 September 2009 doi: 10.1097/WNR.0b013e32832ff287 第第3 3章章 细胞工程细胞工程166小结小结iPS技术？技术？iPS细胞？细胞？iPS细胞的价值？获得细胞的价值？获得iPS细胞的基本过程？细胞的基本过程？科学杂志对科学杂志对iPS的年度评价在线视频。的年度评价在线视频。http:/www.sciencemag.org/cgi/content/full/322/5909/1766b生物谷生物谷iPS专题专题http:/