蛋白印迹成功指南

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1、蛋白印迹成功指南蛋白印迹技术是阐释生物过程和疾病背后复杂信号事件的强有力工具。本文重点阐述了蛋白印迹操作 流程中的关键步骤，并展示了操作流程变化对您最终印迹结果的影响。源自 Cell Signaling TeChnology | WB2简介蛋白印迹也称作免疫印迹，是一种被广泛应用并得到公认的技术，用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。这一技术利用抗体与特定待检测蛋白的结合，测定生物样本中的蛋白水平。抗体与其靶点蛋白表位的精确结合可用于检测蛋白质中具有高度特异性的氨基酸序列。抗体也可检测蛋白质的特异性翻译后修饰（PTM）。磷酸化特异性抗体已用于确定特定信号通路组分以及研究在不同生物学背景下磷

2、酸化事件的变化。 最近研发出了针对其他 PTM 的特异性抗体。这使得研究人员可以监控蛋白质乙酰化、甲基化或泛素化状态的变化。Cell Signaling Technology（CST）的科学家每天进行一千多次免疫印迹实验以验证我们现有和新的抗体。过去十多年我们一直对免疫印迹操作流程进行优化，您可以参阅第13页，也可以在线阅读（见下面链接）。这样您可以重复这一过程并得到可重复且可靠的结果。在此，我们将重点讲述蛋白印迹操作流程中的关键步骤，并展示操作流程变化对您最终印迹结果的影响。我们还将讨论在您的免疫印迹试验中使用经严格验证抗体的重要性。最后，我们将提供CST科学家常用且最适用于与抗体配套使用的

3、试剂清单。蛋白印迹技术是了解生物过程和疾病背后 复杂信号事件的强有力工具。 WB实验结果* 见产品说明书 建议2SDS-PAGE 在适当的条件下电泳3湿转移 至硝酸纤维素膜4封闭 在含5%牛奶的 TBST 中5一抗孵育 在4、含5% BSA 或脱脂牛奶* 的 TBST 中孵育过夜9检测 在用于化学发光检测之前， 立即混合试剂8洗涤 在 TBST 中3x5分钟7二抗孵育 室温下1小时于含5% 脱脂牛奶的 TBST 中6洗涤 在 TBST 中3x5分钟17580584630177 + + + +U0126 TPAPhospho- p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204)p44/42/

4、 MAPKOverlay10成像 化学发光成像具有 更大的灵活性并且 操作简单在此，本文概述了我们所推荐的操作步骤，并讨论成功实验的关键步骤。根据我们在免疫 印迹方面的丰富经验，作为我们验证、批次测试和技术支持流程的一部分，我们将给出试 剂和实验过程的建议。尽管免疫印迹技术被广泛应用和认可，但是仍会出现问题导致出现 次优结果，这可能会耗费时间且令人沮丧。本文旨在通过提供建议，帮助您在最短的时 间、以最少的终端用户优化调整得到预期结果，提升免疫印迹效果。样品制备 裂解缓冲液和超声处理 = 更好的释放出蛋白tissue or cellshomogenous solution+ + 重要性一抗是影响

5、数据质量的关键试剂。质量较差的一抗可对实验结果造成干扰，导致结果无法解释或存在误解。要确保抗体对待检测靶标具有特异性，则应验证抗体特异性。验证抗体特异性时，只在预期分子量位置观察到条带是不够的。抗体应经历严格的验证过程，采用若干不同的方法确保抗体能准确检测靶标。抗体验证包括： 在已报道证实蛋白表达的细胞和组织提取物中进行特异性检测，而不仅仅是在重组 蛋白中。 通过使用 siRNA 转染或敲除细胞系进行特异性确认。 用诱导或抑制靶标蛋白表达的生长因子、化学活化剂、或抑制剂处理细胞系，直接 进行翻译后修饰的抗体特异性检测。 通过磷酸酶处理，对磷酸化抗体进行磷酸化特异性检测。 性（U0126 处理）

6、和阳性（TPA 处理） Jurkat 裂解产物，以及纯化重组的酪氨酸磷酸化蛋白，评估 Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) 抗体。使用经严格验证抗体和纳入适当实验对照的重要性体现在：其他供应商抗体在阴性对照裂解产物中以及与 非靶标磷酸化-酪氨酸蛋白的交叉反应情况。上样对照用于确保凝胶上样量相等，以及样本的完整性，且在对免疫印迹结果进行定量比对时也很重要。当使用修饰位点特异 性抗体评估蛋白活化位点变化时，应使用相应的总蛋白抗体，以确保相同的上样量和样本完整性。在许多细胞系和组织中持续 表达的蛋白，如 -actin、 -tubulin 和 GAP

7、DH，在旨在比较多个样本的总蛋白水平的实验中通常被用作上样对照。当您制备细胞核和细胞质提取物时，应使用细胞分离标志物，用于确认裂解产物制备适当。组蛋白 H3 为细胞核蛋白，核纤层蛋白 Lamin A 为核膜蛋白，它们均是重要的细胞核分离标志物。胞浆蛋白（如 MEK1/2）和细胞骨架蛋白，如 -actin 和 /- tubulin， 是常见的细胞质标志物。 和处理信息，以便您获得有效的对照裂解产物。kDaUO126TPAPDGFREGFRCSFRSrcTie2FLT3c-KitVEGFRc-AblMetHER2IRPhospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr2

8、04) (D13.14.4E) XP Rabbit mAb #4370200 140 100 80 60 50 40302010Jurkat LysatekDaUO126TPAPDGFREGFRCSFRSrcTie2FLT3c-KitVEGFRc-AblMetHER2IRAlternative Provider 1200 140 100 80 60 50 4030 2010Jurkat LysatekDaCST Phospho-Tyrosine #9411200 14010080 60 50 40 302010UO126TPAPDGFREGFRCSFRSrcTie2FLT3c-KitVEGFR

9、c-AblMetHER2IRJurkat LysatekDaAlternative Provider 2200 140100 80 60 50 40302010UO126TPAPDGFREGFRCSFRSrcTie2FLT3c-KitVEGFRc-AblMetHER2IRJurkat Lysaterecombinant proteinsrecombinant proteinsrecombinant proteinsrecombinant proteins这些结果表明#4370表现出超常的 特异性。应用一组重组酪氨酸-磷酸 化蛋白的免疫印迹分析显示，采用 Phospho-p44/42 MAPK

10、(Erk1/2) (Thr202/ Tyr204) (D13.14.4E) XP Rabbit mAb #4370 时未检测到交叉反应，而采用其他 厂商提供的抗体检测其他酪氨酸磷 酸化蛋白时出现显著的交叉反应。 Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) #9411用于展示蛋白上样和验证标签 重组蛋白的分子量。6所推荐操作流程中的 关键步骤 这些步骤非常重要操作步骤的变化可对免疫印迹结果产生显著影响。我们对裂解产物制备、凝胶、转移、膜、缓冲液、封闭以及抗体稀释和孵育等操作流程步骤的常见差异进行了测试，并找出得到理想结果的方法。您将在后面几页见到一些数据，这些数

11、据用于确定我们推荐的免疫印迹操作流程中的关键步骤。 虑选用表达水平更高的其他细胞系。应查阅基因表达数据库，评估特定细胞系和组织中的蛋白表达水平。疑难排解提示裂解产物制备确保完全裂解并使用新鲜样本 制备样品供分析用时，推荐使用化学和物理方法破碎细胞膜，确保 细胞裂解和释放待检测蛋白。对于组织样本裂解产物，大多数情况 下建议采用匀浆步骤，通常在匀化之前在细胞裂解缓冲液中加入蛋 白酶抑制剂混合物。细胞裂解缓冲液中含有不同程度的去污剂、 盐、和酶抑制剂（如磷酸酶或蛋白酶抑制剂(A)），以裂解细胞， 溶解蛋白，并防止降解。此处展示的是超声处理连同细胞化学裂解 的效果。通常我们建议采用超声处理细胞和组织提

12、取物，而且超声 对于研究细胞核和核染色质相关蛋白至关重要，如组蛋白 H3。此处 (B) 相较于未经超声处理的提取物，我们在超声处理提取物中观察 到了显著增强的信号。这是因为相较于单独裂解缓冲液，超声处理 破碎细胞膜和核染色质的程度更大。我们始终建议采用超声破碎， 以确保整个细胞裂解并剪切染色质 DNA。我们建议在35%-40%的功 率输出条件下破碎3次，每次10秒。然而我们要记住，不同的超声 仪器有不同的性能，应根据生产商的建议进行个性化优化。允许 各次之间间隔10秒，超声处理时应将样本置于冰上。如果您没有探 头超声仪，用细的注射器针头反复吹打也能破碎细胞膜和剪切 DNA。一般说来，相较于细胞

13、系提取物，细胞和组织初次提取物含有更多 的背景条带和降解产物。使用新鲜、经过超声处理和澄清的组织提 取物可降低背景。此外，相较于标准裂解缓冲液，在去污剂含量高 的 RIPA 缓冲液中裂解，会得到组织的更彻底和均匀的裂解物。此处 (C) 我们比较了新旧处理的小鼠大脑裂解物。较旧的裂解物产生较 弱的特异性信号和较高的背景。凝胶电泳加入足量的样品和分子量大小标记物 SDS-PAGE 根据蛋白电泳迁移率将其分离，迁移率是蛋白大小和电 荷的函数。我们建议在预制 Tris-Glycine 小孔胶上样20-30g 总蛋白。 对于大分子量靶标，我们建议采用 Tris-Acetate 凝胶和相关缓冲液。 应在待

14、测样本附近的泳道始终加入分子量标记物，作为参考点。 分子量标记物（或梯状条带）是已知分子量的纯化蛋白的混合物。 采用预染色标记可以看见电泳过程中蛋白迁移的距离，随后确认经 电转移至膜。采用生物素标记物可以看见膜上的梯状条带和抗体靶 标。将两种类型的标记物都加入非常有用，既可以监测实验进展， 也易于解释结果。(B) 超声裂解物对于观察细 胞核和染色质结合蛋白 具有决定作用。 免疫印迹分析 CKR/PAEC 细胞提取物，未用或使 用山梨醇处理，以及使 用或未用超声裂解处理， 使用 Phospho-Histone H3 (Ser10) Antibody #9701。kDa-SonicatedUnso

15、nicated+-+sorbitol100 8060 5040302010Phospho- Histone H3 (Ser10)kDaTrk (pan)1401008060 5040oldnew(C) 新鲜裂解产物由于降解水平 较低，生成显著更强的特异 性信号和更低的背景。免疫 印迹分析小鼠大脑提取物， 可在使用前三个月制备（新） 或使用前一年制备（旧）， 采用 Trk (pan) (C17F1) Rabbit mAb #4609 。抑制剂靶点最终浓度 抑肽酶胰 蛋 白 酶 、 糜 蛋 白 酶 、 血纤维蛋白溶酶2g/mL亮抑酶肽溶酶体110g /mL胃蛋白酶抑制剂 A Asp 蛋白酶1 g /mLPMSFAsp 蛋白酶1 mMEDTA镁和锰金属蛋白酶15 mMEGTA钙金属蛋白酶1 mM氟化钠丝氨酸和苏氨酸磷酸酶510mM原钒酸盐酪氨酸磷酸酶1 mM