《氧自由基在慢性胰腺炎发病机制中的作用及抗氧化剂治疗》由会员分享，可在线阅读，更多相关《氧自由基在慢性胰腺炎发病机制中的作用及抗氧化剂治疗（67页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、上海第二医科大学硕士学位论文氧自由基在慢性胰腺炎发病机制中的作用及抗氧化剂治疗姓名：朱颖申请学位级别：硕士专业：内科学（消化系病）指导教师：袁耀宗2003.4.1氧自由基在慢性胰腺炎发病机制中的作用及抗氧化剂治疗中文摘要目的：通过对大鼠胰腺长期的氧化刺激建立大鼠慢性胰腺炎的动物模烈。研究氧自由基在慢性胰腺炎发瘸机制中的作用，并在此基础上探索抗氧化剂对慢性胰腺炎的治疗作用。方法：1 建立动物模型：D E T C ( = 乙魅= 硫代氨基甲酸盐，D i e t h y l d i t h i o c a r b a m a t e ) 法采用雄性W i s t a r 大鼠6 0 只，分为对照组(
2、 n _ 3 0 ) 和D E T C 模型组( n _ 3 0 ) 。D E T C 模壅组每周两次在大瓯睃膜内注射D E T C ，剂量为7 5 0 m g k g ，对照缀注射垒瑾魏承。在2 w ，3 w ，知，5 w ，6 w ，8 w 对处死大鼠。T N B S ( 三磷藿苯磺酸，t r i n i t r o b e n e n z es u l f o n i ca c i d ) 法浆雳雄洼S D 大鬣4 8 只，分为燕常怼照缀( 拶8 ) ，缀手术缝( 珏_ 2 e ，T N B S 模麓缓( 轳2 0 ) ，T N B S 模型组在大藏胰篱内注入会2 T N B S 鄹1
3、0 酒壤的磷酸缓 孛盐溶渡( P B S ) ，假手术组注入不含T N B S 的l O 滔精磷酸缓冲盐溶液。2 w ，4 w ，6 w ，8 w 时处死大鼠，邋过兔疫缀化的方法检测胰腺组织内a 一平滑肌肌动凝白( 泓s m o o t h m u s c l e a c t i n ，伐S M A ) ，结蛋白( D e s m i n ) ，胶原I ( C o l l a g e n I ，c oI ) ，胶原I I I ( C o l l a g e n I I I ，C oI I I ) ，转化生长因子Bl ，2 ( T r a n s f o r m i n gG r o w t h
4、F a c t o r 1 3l 巾T G F DL 2 ) ，纤维连接蛋臼( F i b r o n e e t i n ，F N ) 的表达。通过反转录聚合酶链反应( R T - P C R ) 检测T G F - B1m R N A 和F Nm R N A 在胰腺组织内豹表达。2 抗氧化治疗：2 4 8 强雄髋W i s t a r 大鼠分为正常对照组( n - 8 ) ，慢性胰豫炎模整缎( n = 1 2 0 ) 和治疗组( n = 1 2 0 ) 。穰垄组分为三组，每周两次在大鼠簇控内注射D E T C ，裁鬟分裂秀5 0 0 m e f l k g ，7 5 0 m g k g 或
5、1 0 0 0 m g k g 。治疗缝氇分淹三维，没瓣7 5 0 m g k g 瓣D E T C 及1 5 m g k g 维生索E ( V i tE ) ，1 5 m g k g维生素C ( V i tC ) 或l O O m g k g 哩氨啦嗡二酸代缀基帮酸鼓( P y r r o l i d i n eD e r i v a t i v eo fD i t h i o c a r b a m a t e ，P D T C ) 。正嚣对照组不做任何处理。每组每时间点备取5 只大鼠，转别在9 0 m ，2 4 h ，4 8 h ，7 2 h ，2 w ，3 w ，4 w ，6 w 时盘
6、b 死，检测胰腺组织中S O D ，G S H P X 活性和M D A 的含量，后4 个时间点通过免疫组化的方法检测胰腺组织仪S M A ，D e s m i n ，C oI ，c oI I I ，T G F Bl 巾F N 的表达，通过R T - P C R 检测T G F 1 3 1 m R N A 和F N m R N A 在胰腺组织内的表达。结果：D E T C 组和T N B S 组大鼠在3 - 4 w 后出现胰腺的纤维化，免疫组化方法示胰腺组织内C oI ，C ol l I ，F N ，S M A ，D e s m i n ，T G F 1 3l ，2 呈阳性表达，通过R T P
7、 C R 可见T G F Blm R N A 和F Nm R N A 阳性表达。在大鼠腹膜内注入D E T C后很快引起胰腺组织S O D 下降，M D A 升高，G S H P X 减少，胰腺出现水肿、空泡样变等病理变化，而对肝、肾、脾影响较小。用抗氧化剂干预治疗后，胰腺S O D ，G S H P X 下降和M D A 增多均不如模型组明显。D E T C 模型组大鼠3 w后开始出现较为明显的小叶间及小叶内纤维化并伴炎性细胞浸润，6 w 左右纤维化达到高峰，腺体萎缩及小叶结构破坏明显，与正常对照组相比有显著差异( P 0 0 5 ) 。通过免疫组化方法可见治疗后胰腺组织C oI ，C oI
8、 I I ，F N ，o r - S M A ，D e s m i n ，T G F 1 3 I 在组织内表达减弱，C o I ，C o I I I ，F N 尤为明显。通过R T P C R 检测发现T G F Blm R N A 和F Nm R N A 在模型组胰腺组织内表达增强，治疗组中两者的表达较模型组有所减弱，但仍高于正常对照组( P 。D E T C 模型缀每周两次在大鼠腹膜内注射D E T C ，剡量为7 5 0 m g k g ，按l O O m 影m l 熬滚瘦建生瑗慧瘩耩聒，对照鳃在黢腔蠹注射等量不食D E T C 的嫩理赫水，分别在2 w ，3 w ，4 w ，5 w ，
9、6 w ，8 w 时将大鼠处弼，镣8时蠢点毅5 只大鬣。r取体重2 2 0 。2 5 0 9 雄性S D 大鼠4 8 只，分为正常对照组( n _ 8 ) ，假手术组( n = 2 0 ) ，T N B S 模型组( n = 2 0 ) 。正常对照缀大鼠不设经鹰处璞，瑕手术缀和T N B S 模型组大鼠在术前禁食不禁水1 2 小时，用2 5 戊巴比妥腹腔内注射麻醉。疑固定后常授消毒镶巾，取黢黩正中切翻，沿腹暇线将腹壁肌肉剪开，用止舰钳充分暴褥腹腔，寻及十二指肠，找到胰腺，用棉签将胰腺暴露清楚并摊平胰腺，使胰腿管近肠端平整，用动脉夹暂时阻断胰腮管肝门端。找到胰嚣在一卜= 指肠的开翻，用2 4 号
10、静称套警钟穿嗣入十二指瀚，取下钟头，将外套管从胰管十二指肠开口处插入胰管，用丝线固定套管针。T N B S 模型组通过恒流静藤输注泵注射含2 T N B S 帮1 0 g , 释翡磷酸箍缓滓滚筵0 4 m l ，在6 0 分锋漆注射完毕。再经套管针注射生理盐水o 1 m l ，约在5 分钟内注射完，使T N B S完全遂入黢豫缝织。去除憝簇管_ | l 予门潦愆韵熬必，去豫丝线，缝合腿藩窝菠默，同时皮下注射青霉索8 万U 。术后大鼠禁食2 4 小时，不禁水，术尉三天内每天皮F 注瓣毒霉素8 万U 敷貔零螽感染。缓手零缀手术方法及术蜃建淫均与模型组相同，但在胰管内注入不含T N B S 的1 0
11、 Z - 醇磷酸盐缓冲液O 4 m l 。在2 w ，4 w ，6 w ，8 w 特大鼠处死，每时间点取5 只大鼠。2 标本的留取及处置术质戏察大鼠的存活情操，有无感染发生。各时间点处死大鼠时，先用乙醚麻酪，取腹壁燕中切1 ：1 打开腹腔，经腹主动脉抽取血液，盼备血清淀粉酶的测定。将胰腺组织暴露充分，用眼科剪小心取下整个胰腺，并注意区分胰腺和获周豹l 警豌组织。胰藤分头、惩都务淑2 X 2 m m 大小胰腺组织霜2 疫二醛豳定，咀便电镜检测；取5 5 n u n 大小组织固定于1 0 中性福尔马林中，以便石疆毽瀵，迸一步行H E 染氇秘免疫缀往检测；菸余部分分头遥羽滚氮镶存，激各行R T P
12、C R 检测。3 。H E 染色1 ) 切片脱蜡水化：3 7 。C _ - - 甲苯1 5 分锄2 次，无水酒精5 分钟2 次，9 5 酒精5 分镑X 2 次，7 5 溪精l O 分9 t , 1 次，双蒸承冲淡5 分钟水他。2 ) 苏木索染色5 分钟，流水冲洗3 分钟。3 ) I 盐酸酒精分化3 0 秒( 抽提数下) ，双蒸水冲洗5 分钟。94 ) 伊红染色3 分钟，双蒸水冲洗5 分钟。5 ) 脱水、透明：7 5 酒精5 分钟1 次，9 5 酒精5 分钟X 2 次，无水酒精5分锌X 2 次，二译苯2 分释2 次。6 ) 中性树鬻封片、箍照4 。洳S M A ，D e s m i n ，F N
13、 ，C o l ，C o I l l 襄T G F 1 3 ，2 戆检测方法一) c L - S M A1 ) 切片脱蟥水他：3 7 “ C 二甲苯i 5 分锄2 次，光水澄糖5 分钟X 2 次，9 5 淄精5 分钟2 次，7 5 酒糟1 0 分钟1 次，双蒸水冲洗5 分钟水化。2 ) 用3 过氧化氢淬灭内源性过氧化物5 分钟后P B S 冲洗3 分钟3 次。3 ) 用羊血清封闭非特异性抗原1 0 分钟。插去多余试剂但不要过洗。4 ) 加抗S M A 单克隆抗体或阴性对照，3 7 。C 孵育6 0 分钟绒4 。C 过夜，用P B S冲洗3 分钟3 次。5 ) 蕊结合生物索的二抗3 7 。C 孵
14、育3 0 分锌，P B S 冲洗3 分钟3 次。6 ) 翻抗生物素强自的过畿住耪酶室溢弼分镑，P B S 冷洗3 分锌3 次。7 ) D A B 染色裁显色，显微镜下翳察鞋接毒l 显色露阙。8 1P B S 冲浚3 分铮X 3 次。9 ) 苏本素复染1 分钟，流水潍洗。1 0 ) 1 盐酸酒糟分化3 0 秒，流水冲洗。1 1 ) 脱水、透明：7 5 酒糙5 分钟1 次，9 5 酒精5 分钟2 次，无水灏精5分钟2 次，二甲苯2 分钟2 次抽提数下，双蒸水冲洗5 分钟。1 2 ) 中性树脂封片、拍照二) D e s m i n1 ) 脱蜡水亿步骤同前2 ) 掬梅橼酸工作液徽波修复1 5 分钟x
15、2 次3 ) 淬灭巍源性进氧偬耪、封鬻 特异经抗藩步骤闲蔫。4 ，热结含建绣豢戆羧D e s m i n 攀壳隆摭体或戮性对照，3 7 “ C 孵弯6 0 分镑竣4 “ C过夜，照P B S 申洗3 分镑3 次。5 ) 加抗生物索蛋白的过氧化物酶室温3 0 分钟，P B S 冲洗3 分钟3 次。6 ) D A B 显色，苏木索复染，脱水遴明，封片等步骤同前。1 0三) F N ，C o I 和C o I I I1 ) 脱蜡水化步骤同前。2 ) 用O 1 胰酶消化液3 7 。C 消化2 0 分钟。3 ) 淬灭内源性过氧化物，封闭非特异性抗原步骤同前。4 ) 加抗F N 单克隆抗体或阴性对照，3
16、7 。C 孵育6 0 分钟或4 。C 过夜，用P B S 冲洗3 分钟3 次。5 ) 加结合生物素的二抗3 7 。C 孵育3 0 分钟，P B S 冲洗3 分钟X 3 次。6 ) 加抗生物素蛋白的过氧化物酶室温3 0 分钟，P B S 冲洗3 分钟3 次。7 ) D A B 显色，苏木素复染，脱水透明，封片等步骤同前。四) T G F 一1 31 2 测定同a S M A5 逆转录一多聚酶链反应( R T P C R ) 检测T G F Bl ，F N m R N A 的表达。1 ) 总R N A 的制备用T r i z o l 抽提。步骤为：将保存于液氮中的胰腺组织取出，剪取5 0 1 0 0 m g ，置于盛有T r i z o ll m l 的2 m le p p e n d o r f 管中，冰浴条件下用剪刀将其剪碎并用匀浆器匀浆。在1 5 3 0 。C 环境下孵育5 分钟，按标本比
