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1、浙江大学硕士学位论文VEGF体外诱导卵巢癌细胞株STAT3磷酸化的研究姓名：王芬芬申请学位级别：硕士专业：妇产科学（妇科肿瘤）指导教师：谢幸;叶大风2003.5.1新缸大学2 0 届硕士学位论文V E G F 体努诱导卵巢癌缨鏖株S T A T 3 磷酸诧的研究辩莲大学尊6 七婵制譬露始产辩警王芬芬谢幸叶大风摘要教授副教授f f 背蒹L 郛熊整是选今臻露蛙差靛始趣恶搜辨癌，魄魏瘸例5 年生襻辜仅1 S 2 0 ，究其原因之一，魁初诊时大多数瘸人己麟晚斯伴广泛的腹腔内播散和大量的麟承形袋。盘警蠹霞篷长强予( V E G F ) 参与了赛桑蠖懿进蓑帮菝隶澎琏，愚一个重要斡与卵巢瘸漫润转移和臊水形成
2、相关的艇长因予。有关研究证爨在人类的胃晒道，鬻，襄骤，瓣膦，蒋烈踩骧及郛巢等多个帮霞躲静癀鄯毒V E G F 静商袭这。羧诀为，V E G F 通趱作用乎血管内皮细胞健进新嫩舡管形成。其机制主疆是V E G F 与V E G F R s 酶结合健迸赢营内皮缎艟酶增殪，游淹，并增搬锾盘替矮透程。V E G F 谯瞧譬内疫缎腿捧蠲予V E G F R s ，遥避M A P K ，P 1 3 K ，P L C Y 等信号转姑途径介导信号t 发挥生物学效应。最近有体外研究麓现在斑管内皮纲胞中V E G F 的信号转母有J A K - S T A T癌号耱导逶黪的参与。在嚣薨培葬嚣盘警蠹受缨照，V E
3、G F 的裁巍可以 起S T A T s磷酸化增强，谶一步调控下游靶基因的转录。邋年菱魂，在备静静癌缎脆逛毒寝藿V E G F R s 鹃表逮。黪瘙露憨袭运V E G F R s提示V E G F 不仅可通过旁分泌途径作用于血管内皮细胞，促进新生虹管的形成，支持释瘸囊长，稳可齄奁静癌缅穗垮通过禽分澄辩方式直接箨用于瓣瘫缨穗奉费，燕遴艘癯壤胞的生长和抗嬲亡。但对于在肿瘤细胞内。V E G F 如何转导信息，是否遵循血管内皮细胞内的信号转导途径，尤其燕S T A T s 是否费与了精鸯转导疆箭潜不稿臻t塑鞭盔兰垫塑旦黧生兰丝堡奎在露鬟臻簿鑫静静筌孛熬存在毒S T A T 抟接续港倦，S T A T
4、 3 耱嚣露薤纯鬻黎毒黪癣 韵发生- 筱展有关，舯瘸细箍高袭滤V E G F R s 釉商活纯豹s 忡，提示S T A T s 磷酸 化激浩极谢可能参与了肿瘤细胞内v E o F 信号转婚的过程。矿奉磷巍采是受疫瓣藏蹙学窝W e s t e r nB l o t 熬寅洼，溅霆主霾瞧雾鬓攥麴蕤赣在律井经不掰浓度和不冈作用对阉静V E G F 作魇下V g G F R 2 和p - S T A T 3 韵表达，并采用能与V E G F R 2 特异性绌愉的短肽阻断V E G F 封卵巢癌细胞的拌用，以观麟p - S T A T 3虽委参舞辩鬟整鳃爨拣￥E G F 羹蓑警鼗导；鏊整攥襄￥蕊F 嚣察纂
5、蹇耋接豫惩懿舅子机制。l藩糕瀚鑫法 以上皮性卵巢癌期胞株S K O V - 3 。C a o v - 3 3 a o 为研究对氰，采用V E G F ( 5 0 n g m I ，3 0 m i n ) 制激三个缨簏拣捧舞实验缎。嚣V E G F 粼激憋三个缨皴撩作隽对照缝，检测p - S T A T 3 豁V E G F R 2 袭选，蓊选出黎袭透V E G F R 2 积p - S T A T 3 ，并基藩￥翳F 黼激表建p - S T A T 3 缀应性高的绷胞株作为逃一步研究的对照。采用脊删浓度( 0 ，5 。2 5 ，5 0 ，t 0 0 n g m t ) 霹不冠俸趟瓣霹( 0 ，
6、1 5 ，3 0 ，4 5 t6 0 m i n ) 鲍V E G F 测激郛巢燃潮鹰，鼹寨V E G F 静髑囊薅辩懿疼舞箍p - S T A T 3 表达鼹躲镌。遴一莎器矮驻A 鞣L 糌懿藩为V E G F R 2 的阻断剂，谯不同浓度短肽。根据噬菌体展示肽库筛选的能与V E G F R 2 特异性结裔白哿七肤，其序刿为A T w L p P R ( 丙氨酸一搭氨酸一色氨泼一亮氨酸一脯甄酸一脯氨酸一精氨鼗) ( 魏裹 S ) 主海孛发生秘技术蠢隈公司台残蛋白印遮( W e s t e r nB l o t )3 0 聚丙烯酰胺溶液T r i S 、S D S 、A P S 、T E M E
7、 D鼠抗V E G F 单克隆抗体( C - 1 )S a n t aC r u z兔抗V E G F R 2 多克隆抗体( C - 2 0 )S a n t aC r u z1 3浙江太学2 0 0 3 届碉士学位论文垂羊裁磷黢饱S T A T 3 ( T y r 7 0 5 ) 多竞陵抗体S a n t aC r u z山羊抗8 一a c t i n 多克礁抗体S a n t aC r u z二抗：扰鼠I g G H R PS a n t 8C r u z抗受l g G 一箍R PS a n t aC r u z抗山挲I g G H R PS a n t aC r u zE C L 显色试
8、剂盒S a n t aC r u z显影菠、定影滚缓冲液。加样缓冲液；T r i s 甘氮酸电泳缓冲液；转秽缓冲液：T B S T ；T B S ；瓣闭液鞘蘸终壤寨膜S c h l e i c h e r 曩S e h u e ll觎疫细胞化学( I 蛐u n o c y t o c h e m i s t r y )载玻片、靛玻片；2 5 * 戊二醛；N P 一4 0一撬：瓣上二抗：嫩物素化抗山攀s P 试剂畿北京中山生物技术公司生物素化抗兔S P 试剂盒北京中山生物技术公司D A B 酪燕耪显龟蘸裁鑫透羲公罚盅要的仪器：蔹器名二氧化碳培养箱超净台羹萋疆蓑慝徽系统灭菌锅电泳仪转骥竣备摇床低温
9、高速离心机采浴籍或豫议釜黉F o r m aS c ie n t i f i c苏州中戴净化设备脊限公司K K O N苏泊尔B i o - R a dB i o R a d太仓帮科教器材厂E p p e n d o r f上海匮瘸整遗设誊 rB i o - R a d。，塑鹜纛囊! ! 塑璧篓点蹩熊篷塞兰、鬟麓蠢法1 ，麴蕤臻葬( C e l lC u l t u r e )S K O V 吣、C a o v 3 ，3 8 三释上皮矬辩攥攫雏胞姆姻趱含l 孙胁牛舷瀵熬R F 艇一i 6 4 0 辩嚣蕊，霎7 ，糕黪；凌翘燮建莠，辫瓣簿篾臻嚣，舔黼2嚣羧渡一凌，簿骧3 4 炎， ) ，2 5 藕
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11、 敬 拨奏验多骥3 然缕。辩：V E G F 裁起p - S T 女, T 3 鞋撼敬爱舞建实验缝 ￥黼F ( 5 0 n g m l 。3 0 m i n ) 粼瀑S O V - 3 ；C a o v 一3 ，3 a o 纛个瓣臆瓣照溪；麓V E G F 裁溅$ K O V - 3 ，C a o w 3 ，3 a o 三个攒整蓬黎F 潞游虚，盖簸篾簸突验雾骥瓢避葬潺簿彝攘娄袈爹鬻瓣襻2 V E G F 翩擞a o v - 3 缨艟D S T A T 3 裘遮瓣藩渡莜羧镁鞫辩蠲莜鞍缓矗：苓霆滚黢V E G F O g m l 。5n g m l ，2 器n g m t ，濑n g m l ，1
12、 9 n 趣l 蓊囊C a o v - 3 整巍，潮激游蔫嚣疆i n + 蓬馥擎鹅麟毙黎爨；B ：V E G F ( 霉m 1 ) 蒯激C a o v - 3 缨蕤；麓激精续簿麓琴器( 勰i n ，I S m i n ，3 0 * i n ，融i n ，6 0 m i n 9 0 m i n + 黼拣P B S 终娆艇成；盏凌羚攘察簧寥蔫3 瓣尊，饕释激壤器羧妻夔涉爨毒爨雾3 麓款薅￥g 澄$ 起p - S T A T 3 表这增缓秘瓣蘩纛：不弼浓燃的短疑o 越烁4 0 # 艟8 0 # ，j 6 仕p 醛，3 2 0 硅骚善S 0n g 抽j V 瞄p荚嚣裁激e 嚣￥一3 鬃激，鬟滚嚣瓣黼箍
13、i 襄；委舔P B S 终主囊藏 B ：短驻8 0 # 耩) 与V E G F ( 5 0 n g m 1 ) 燃C a o v 一3 巍艇，裁嶷势续瓣秘苓鬻( 0 m 孙，1 5 m i n ，3 0 m l n ，4 5 m i n ，6 0 m i n ，9 0 m 1 ) $ 用冰P B s 赡止反应羞襞蠢燃蹩整实验黪瓣3 爨骞，薅黎莲薅葵糕瓣攘实验雾爨4 潦箨t渐髓太学2 0 0 3 届碗士学位论文3 、免痉绷蕤纯攀薹醐珏取蚤o y 毫爵e b 耘鞋i s t f y )拣奉罄定( 1 ) P B S 冲洗3 次；2 2 。鞴蕊= 醛蓬嶷 I S m i n ；( 3 ) P B S
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15、3 援；( 8 ) 加入生糯索标记的免瘫臻蛋宣( 联接裁，室漱下孵育l 黼 n ；( p ) P 器s 器浚渡鹭，势浸港冀中，瓢i n 3 凌；( 1 0 ) 加入过瓶化物酶标记的S t r e p t a v i d i n ，整温下孵育1 5 m i n #i l ) P B S 薅潦玻冀，弗浚滤箕孛，3 i # 3 次；( 1 2 ) 接疆鹗漤配裁瓢g 溶渡，显色；( 1 3 ) 篷来承燕劳狰洗，游本素复染，母性糖脂羹焦*键蠛实验蠕如做阴性对照片澍照( 以P B S 缓冲液代替抗辫育，寐步骤不燮) 。毒、辫鑫露滚( 蔫e s t e r nf l l o t )蟹囊提墩( I ) P B
16、 S 缓冲液终止葳成，冲洗3 敬；2 藏天登歉裂簿藏2 0 簪馥薄a 蠡￥ ，藩主瓣誊3 0 m i n ：( 3 ) 用橡皮制匙刮下绷胞4 ，1 2 0 0 0 转箭离心1 5 m i n ，墩上清。分装- 2 0 “ C 贮存：浙江大学2 0 0 3 届硕士学位论文蛋白印迹( 1 )蛋白变性：8 4 变性5 m i n ，立即置入冰上：( 2 )电泳：2 0 0 V ，l O m i n 1 0 0 V ，1 2 0 m i n ：( 3 )转膜：I O O V 1 2 0 m i n ：( 4 ) 封闭：脱脂奶粉封闭液，封闭3 0 m i n ；( 5 ) 一抗：p - S T A T 3 ( T y r 7 0 5 ) 一抗( 1 ：1 0 0 ) ，B a C t i
