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1、杜塘水库微囊藻的分离培养杜塘水库微囊藻的分离培养研究研究【摘要摘要】 以杜塘水库野生微囊藻为研究对象，利用毛细管法和等比稀释平板法成功的分离出微囊藻 单株，初步鉴定为挪氏微囊藻（Microcystis novacekii ），研究表明其生长曲线符合典型的 S 型单细胞藻 类生长曲线，细胞平均生长速率常数 k 为 0.508，细胞平均倍增时间为 47h。通过研究不同温度条件对该 藻生长的影响表明温度是影响该微囊藻生长的重要因素，在 2500lux，光暗比 12h：12h 时，随着温度的升 高，该微囊藻的生长速率逐渐增大。低温（15）显著抑制微囊藻的增长，该微囊藻生长的最适温度为2530。【关键词
2、关键词】 温度；分离纯化；微囊藻 水体富营养化对水资源利用造成了很大危害，如自来水厂滤池的堵塞，藻类死亡产生恶臭，水体 DO 值下降，以及“水华”毒素引起动物中毒及饮用水安全等问题。因此，研究水体藻类生长的规律及 “水华”形成的原因，寻求防治对策，已引起许多学者的重视。 杜塘水库位于福建省漳州市云霄县境内，建成于 1958 年，水库集水区面积约为 24.21km2，实际 库容为 1.27107m3，水面面积约 0.9km2，最大水深约 30m，平均水深 14m，是东山县及邻近的常山经 济开发区等乡镇的主要饮用水源，年供水量约 1.255107m3，供水人口 24.1 万人。2007 年 9、1
3、0 月 份，杜塘水库发生大面积水华，水库表层水体呈现浓绿色，局部水面形成粘液状粘稠物质，直接威胁 到当地居民的生活饮用水安全，引起了省市有关部门的高度重视。杜塘水库藻类的优势种为微囊藻， 其种类达 67 种，本研究对其中常见的一种微囊藻进行分离纯化培养，为研究微囊藻的分离纯化技术 及生物学特征研究积累有用的资料。1 1 实验材料与仪器实验材料与仪器1.11.1 试剂试剂90%丙酮 PH7.5 50mM Tris-HCl 缓冲液 BG11 培养液：1.21.2 仪器仪器海尔 HRGZ-300A 型光照培养箱 HFSAFE-1200 型生物安全柜 Nikon Eclipse E200 显微镜Nik
4、on Digital sight DS-SM Camera UV-9100 紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司） L-550 台式低速大容量离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司） CRDX-280 型不锈钢电热手提式灭菌消毒器（上海申安医疗器械厂）1.31.3 试验藻种试验藻种杜塘水库分离的野生微囊藻2 2 实验方法实验方法2.12.1 微囊藻的分离纯化微囊藻的分离纯化本实验采用毛细管法结合等比稀释平板法对杜塘水库中的微囊藻进行分离纯化。取 25 号浮游生 物网捞取的水库水样，静置，取少量上浮藻类群体样品镜检，确认大部分为微囊藻属种类后，用吸管 吸取少许上浮的藻类在 200 目筛绢上，用无
5、菌水清洗过滤，除去其中混杂的单细胞藻，留下大部分的 微囊藻群体，再在显微镜下用毛细管挑取微囊藻群体到无菌的 BG11 1原水混合液中培养（水库原水经过 0.45m 滤膜抽滤，高温灭菌处理） ，作为分离培养的原始藻种。再采用等比稀释平板法： 0.9%BG-11 琼脂培养基、25，2500lux，光暗比 12h：12h 培养：数天后，挑选表面光滑、蓝绿色、 直径约 1.5mm 的圆形单藻落，放入装有 10mL 培养液的无菌小三角瓶内培养，生长 12 周后镜检观察。2.22.2 微囊藻的形态特征观察及种的鉴定微囊藻的形态特征观察及种的鉴定分离纯化的微囊藻种置于载玻片上观察并拍照，显微观察和拍照采用的
6、设备为 Nikon Eclipse E200 型光学显微镜，外接 Nikon Digital sight DS-SM Camera，与台式计算机相连拍照，数码拍照和成分NaNO3 K2HPO43H2O MgSO47H2O CaCl22H2O Citric Acid combined with Ferric Ammonium Citrate EDTA Na2CO3 Trace Metal solution H3BO3 MnCl2 H2O ZnSO47H2O Na2MoO42H2O CuSO45H2O Co(NO3)26H2O含量1.5g/L 40mg/L 75mg/L 36mg/L 6mg/L1
7、mg/L 20mg/L2.86mg/L 1.81 mg/L 0.222 mg/L 0.079 mg/L 0.390 mg/L 0.0494 mg/L细胞直径的测量通过其附带的软件 Nikon Elements F2.20(Build 232)控制和实行。软件的图像测量 前，用 Olympus 的物镜测微尺（每小格 0.01m）较正。根据其形态学特征进行种的初步鉴定。2.32.3 微囊藻培养条件及生长曲线的测定微囊藻培养条件及生长曲线的测定计数不同浓度梯度的微囊藻培养液细胞个数（n）2，同时在665nm处测定相应的吸光值，将二者 的值做标准曲线。 取分离好的微囊藻培养液接入250mL三角瓶，内装
8、100mLBG11培养液，25，2500lux，光暗比 12h：12h，每日固定时间测定OD665nm值。以天数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制生长曲线。细胞平 均生长速率常数公式：k=3.322/(n-1)lg(An/A1)，k为藻细胞平均生长速率常数，n为天数；藻细 胞平均倍增时间计算公式：Td=24/k，单位为h。2.42.4 不同温度对微囊藻生长影响的测定不同温度对微囊藻生长影响的测定实验中设定四个温度梯度，分别是：15、20、25、30。实验开始后，每隔一天固定时间测定 OD665nm值。以天数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制曲线。一个周期 12 天。 第 13 天的同一时间测定叶绿素
9、a、类胡萝卜素和藻蓝蛋白的含量。各取 5ml 藻液离心，沉淀悬浮 于一定体积的丙酮(80%)，摇匀，在 4过夜，悬浮液离心，将上清液用来测定叶绿素 a 和类胡萝卜素 (CAR)。另取 5ml 藻液离心，沉淀悬浮于 50 mM TrisHCl 缓冲液中(pH 7.0)，反复冻熔，获得的悬浮 液重新离心，上清液用来测定藻蓝蛋白(PC)。用分光光度计分别测定了 663, 480 和 610 nm 的吸光度来求得 chla, CAR and PC, 分别用公式CChla=13.9*OD663、CCAR=OD480/200、CPC=OD610/7.53 来定量光合色素。最后以温度为横坐标，色素含量为纵坐
10、标绘制柱形图。3 3 实验结果实验结果3.13.1 微囊藻的分离纯化微囊藻的分离纯化本研究通过毛细管法和等比稀释平板法挑取藻落培养，对培养成功的藻液进行显微镜观察，确认 为微囊藻单种，分离成功的微囊藻藻种即为下面实验提供材料。3.23.2 微囊藻的形态特征及种的鉴定微囊藻的形态特征及种的鉴定在显微镜下观察，待分离的微囊藻群体直径约为 50-100m，群体通过胶被连接堆积成更大的球 体或不规则的群体，胶被无色，边界模糊、无折光。胶被不密贴细胞，细胞排列不十分紧密，细胞直 径约 5m，细胞原生质体黄绿色，有气囊，与虞功亮等（2007）描述的挪氏微囊藻特征相符，故初步 鉴定其为挪氏微囊藻，名称为M.
11、 novacekii strain Dutang。 分离后的微囊藻在实验室培养五个月后仍未完全单细胞化，细胞个体较分离前大，但仍有少量以 群体形式存在，群体球形或不规则形状，胶被边缘不明显、无色、无折光，胶被内细胞排列较分离前 的种稀疏，细胞多成对出现，细胞球形，群体内细胞直径 5-8m，单细胞个体较大，直径平均为 8m（图 1） 注. 左图为挪氏微囊藻杜塘株的液体培养照片，右图中 1bar 为 20m图 1 挪氏微囊藻杜塘株照片 Fig 1 Photos of M. novacekii strain Dutang3.33.3 标准曲线及生长曲线标准曲线及生长曲线如图 2 细胞密度与 OD66
12、5呈直线关系，R2=0.9915。故可以通过测定藻溶液的光密度值来代表微囊 藻的生长情况，通过比较光密度值，分析不同环境因子对微囊藻生长的影响。y = 678.49x + 24.449 R2 = 0.9915010020030040050060070080000.20.40.60.811.2 OD665值单位体积细胞数(n104个)图 2 微囊藻细胞密度与吸光值相关性标准曲线 Fig 2 Calibration curve of the concentration versus absorption for M. novacekii strain Dutang at 665nm图 3 显示了微
13、囊藻在接种初始浓度 OD665为 0.037、培养条件为 25，光照强度为 2500lux，光暗 比 12h：12h 的生长曲线，由图中可以看出，此种微囊藻的生长曲线符合典型的 S 型曲线，在生长期前 5 天，增长较为缓慢，为生长延滞期，第 5 天后，进入对数生长期，在第 6 天达到最大日增长速率为 0.5，对数生长期持续到第 13 天，此后进入衰亡期。通过公式计算得出细胞平均生长速率常数 k 为 0.508，细胞平均倍增时间为 47h。00.20.40.60.811.21.41.612345678910 11 12 13 14 15 16 培养天数(d)OD665值图 3 挪氏微囊藻杜塘株生
14、长曲线 Fig 3 Growth curve of M. novacekii strain Dutang3.43.4 不同培养温度的影响不同培养温度的影响对于多数藻类来说，温度是重要的环境因子，尤其是狭温性的种类，温度往往成为其限制性因子。 在本实验中，所设的温度梯度为 15、20、25、30。从生长曲线图（图 4）可以看出，微囊藻在 15 条件下，几乎不生长。在 20、25、30条件下，微囊藻的生长速率随着温度的升高而增大，但是到了 后期、本实验第七天后，微囊藻在 30的生长速度变缓，而 25组的微囊藻继续保持快速生长。从比 生长速率的比较（图 5）来看，微囊藻在 25时生长最快，30条件下
15、的比增长速率明显高于 20条 件。经显著性检验发现（表 1） ，不同温度水平之间，尤其是在低温与中高温之间的效应存在显著差异。00.20.40.60.811.21.41357911 天数(d)OD66515C 20C 25C 30C图 4 不同温度对挪氏微囊藻杜塘株生长的影响 Fig 4 Effects of different temperature on growth of M. novacekii strain Dutang0.01960.21350.34750.303000.050.10.150.20.250.30.350.415202530温度()比增长速率图 5 不同温度对挪氏微囊藻杜塘株比生长速率的影响 Fig. 5 The relative grow rates of M. novacekii strain Dutang under different temperature表 1 低温和中高温对挪氏微囊藻杜塘株生长影响的方差分析表 Table1 Low temperature and high temperature growth of M. novacekii strain Dutang analysis of variance table差异来源 平方和 自由度 均方 F F0.05 F0.01 显著性处理间 0.032 2 0.416
