《同型半胱氨酸对内皮细胞表达ICAM2及与树突状细胞黏附的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《同型半胱氨酸对内皮细胞表达ICAM2及与树突状细胞黏附的影响（74页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浙江大学硕士学位论文同型半胱氨酸对内皮细胞表达ICAM-2及与树突状细胞黏附的影 响姓名：傅婷申请学位级别：硕士专业：内科学（心血管病）指导教师：朱建华20060401湃江大霉磺士攀往论文H c y艘c y主要缩略语A b b 沧v l a t l O nH o m o c y g c e i n e薹 y p 娌h o m o e y s 艳b e l 撼a嗣型半胱氨酸懑同型半觥氨酸巍癃H U V E C s辩u m 缸U m b i l i c a lv 母i nE n d o 氇e l i C e l l s入脐静脉内皮细胞E CE n d O t h e l i a lC e U s内
2、皮细胞站A M 一2I n t e I 牝l l 试a ra d h e s i o nm o l e c 试e - 2细胞闻黏附分子2D eA SD 蝴羽蠢硅ce e l l s h e r o s c l e m s i s瓣突获缨照动脉粥样硬化D c s l 回D cs p e c i n cc t y l ) el e c t 融D c 表达的特异性C 型凝集素F A1 N F 伍赳二P C RF O l i eA e 避时疆n H n o rn e c m s i s t o 卜雠肿瘤坏死因子旺r e v e r s e 订a n s c 邱t i o n 巾o l y m e 瑚e
3、逆转录一聚合酶镳反成c h 越nf e a c 蛀o n浙江戈学硕士学位论文中文摘要同型半胱氨酸对内皮细胞表达I C 伽一2 及与树突状细胞黏附的影晌【目的】近年来认为，动脉粥样硬化( A S ) 是一种慢性炎症和自身免疫性疾病，炎症和免疫是致A s 发病的中心环节。细胞间黏附分子一2 ( I C A M 2 ) 大量表达于内皮细胞表面，特异性介导树突状细胞( D c ) 与血管内皮细胞( E c ) 地黏附及移行，在致A s 的早期免疫应答中起重要作用。同型半胱氨酸( H c y ) 是A S 的一个独立危险因子，但其致A s 的机制尚未完全阐明。本研究通过观察H c y 对人脐静脉内皮细胞
4、( H U C s ) 分泌和表达l C A 】一2 ，以及对D C 与E C 黏附的影响，探讨H c y 在A S 发生中的作用机制。【方法】1 、人脐静脉内皮细胞( H u v E C s ) 培养：取健康产妇剖宫产脐带，用0 1 I 型胶原酶消化获得H U V E C s ，接种于M 1 9 9 培养基( 含1 5 胎牛血清，1 0n 咖lE G F ) ，后每2 到3 天换一次液，直至细胞8 0 融合，用无血清培养基孵育2 4h 后用于实验。用因子抗体鉴定呈阳性，阳性细胞的胞浆内有棕色颗粒。2 、人外周血树突状细胞( D c ) 培养：取新鲜分离的健康成人外周血白细胞悬液，用淋巴细胞分
5、离液收集单个核细胞，再用C D l 4 + 磁珠分选出纯度大于9 8 的c D l 4 + 单核细胞，种于含r l l G M - c s F ( 2 0n m L ) 、r h I L _ 4 ( 2n g m L ) 、1 5 胎牛血清的完全培养基R _ P M l l “O 中，隔天半量换液，第5 天收集悬浮细胞作为未成熟D C 用于黏附试验。2浙汹太学硕士学啦论文3 、髑O 5 m m o l ，L 的 l c y 分捌作用H U V E C s 2h ，4h ，6h ，砭h ，2 4h ，4 8h ，以及分别用O 0 l 姗o l 几，O 0 5 m m 0 1 ，【。，O 1m m
6、 o l 几，O 2 5I n I n o l L ，0 5m m o l 几，1 O l L的H c y 佟用2 4 h 后；用M T T 法检测细胞活力，掰E L I s A 法检测上述培养上清液中强E C s 分泌I c A M 2 的蛋白含量，用W b 妇mb l o t 法检测H U v E c s 表达I C A M - 2 的蛋白含量，用R T _ P C R 蠢检测H U v E C s 表达l c A M _ 2 的m R N A 含鬃。4 、分别用O 5 m m o 扎豹y ，1 0 0 “黼l 见的时羧( F A ) ，F A + H c y ( F H ) ，l O n
7、 g ，m l的肿瘤坏死因子叫科F 旺) ，T N n 时H c y ( T H ) 作厢H u V E c s 2 4 h 后，厢M T l 珐检测细胞活力，月W c 蹴蹦b l o t 法检凛4 H u V E C s 表达I C m d 2 的蛋巍含量，用R T P c R 漩捡测H U v E C s 寝达I C A M 2 的I I l 】R N A 含量。5 、D C 也C 豹黏瓣：用不鞠浓度的 垂c y 以及F A ，F H ，1 N F a ， 僚耀臻E C s 2 4 h后，将标记有c D A 分子探针的D C 加入H 叭，E C s 中，欺孵育1 h 。旗中，O 5 n 黼
8、o I L的H c y 蟾用的H u V 嚣C s 孛郝分加入2 5 壮g 魅L 黪抗入l c A M - 2 抗薅( 攒组) 与D e 、E c 共孵商1 h 。黏附完成后，在共聚焦姓微镜下观察D c 与E c 的黏附情况。【结果】l 、弼O 5 珏珏汽熬 l 昭僚越掇照C s 苓弱越蠲嚣，礤r 班蛇s 鳃嶷溪_ 宠无曼鏊差异( _ P 0 0 5 ) ；上清中I c A M 2 的蛋白分泌在1 2 h 开始高于空白组( P 9 8 p l l r i t ) r 1 1 1 m o s ec e l l sw e r ep l a t e di 1 1R P M I1 6 4 0c o r
9、 l _ t a i i I 培1 5 f c t a lb o 、r i n es e m ms u p p l e m t ：n t e d 埘t h 鲫l u l o c ”e m a c m p h a g ec o l o n y - s t 曲l 撕n gf a c t o r ( r h G M C S F ，2 0 n g ，m I ) a n di n t e r l e l 血i n - 4 L 4 ，2 n 咖L ) C l l l t u r c sw e r ef 酣e v e r yo t h e rd a yb yh a l 0 d a y5 ，b u o y a
10、 n tc e l l sw e r el l a 】e s t e d 嬲i 皿n 啦腿D Cf o ra d h e s i o n 鹤s a y 3 H I E C sw c r ee x p o s e dt oH c ya td i 虢枷Ic o n c e n 仃觚o n ( o 0 1m m 0 儿，O 0 5 n l m o l L ，O 1m m o l L ，O 2 5m m o 扎，O 5m m o l ，L ，1 O 姗o l L ) f o r2 4 h 锄dd i 侬删t t i I n e ( 2h ，4h ，6 k1 2 h ，2 4h ，4 8h ) a t
11、也ec o n c e n 臼锄i o n o f 0 5 n l m o l ，L C e l l 、，i 曲n i t y w a s 撕翻埘讨b yM T T ；E n 刁，l e 一1 i n k e di 瑚硼m o - s o 妇n t 嬲s a y ( E L I S A ) w a sp e 面1 1 n e dt om e 硒u r em es e c 硎o no fI C A M 一2 证t l l es u p e m a t co fc l l l t u r e d E C s ；W e s t c mb l o tw 嬲l l s e dt 0d 曲o c t 廿1
12、 ee x p 嘴s s i o no fI C A M - 2p m t c i I l ；R r - P C R 、a su s e dt 0d 咖皿j n et h ee x p 豫s s i o no f I C A M - 2m R N A 4 H U V E C sw e r ee x p o s e dt oH c y ( 0 5n l m o l L ) ，f o l i ca c i d ( F A ，1 0 0 瑚l L ) ，f o l i ca c i d +H c y 口H ) ，t u m o rn e c r o s i s t o r a l p h “T N
13、F 一旺，1 0 n g ，m L ) ，T N F - 叶H c y 口H ) f o r2 4 h C e v i a b i l 时w a sm e a S u r e db yM T T ；、e s t e mb l o tw a sl l s e dt od 曲e c t 也ee x p r c s - s i o no fI C A M 一2p m t e i I l ；R T P C R 、v a s1 l s e dt od e t e 珊i n e l ee X p r e s s i o no f I C M 一2m I A 5 A d h c s i o na s s a
14、 y ：地rH U V E C s 啪r ee x p o s e dt oH c ya td i 腩r e n tc o n c e I 岣t i o na n dF A ，F H ，T N F n ，T Hf o r2 4 h ，C M F D Al 曲e l e dD Cw e r ea d d c dt 0H u V E C sm o n o - l a y e r sa n dc o i c u b a ：t e df o rl h B e s i d e s ，A 砸- h 啪a nI C A M - 2A n t d y ( 2 5 g m L ) w a sa d d e d
15、而t l l6浙江大学硕士擘位论文l a b e l e dD Ct oH 【E C sw h i c hw e r ep r e 恤a t e dw i mH c ya t0 5I n n l o H I ) a n dc o i n c u b 哪e df o r1 h A d l 】e r c n tc e l l sw e r ei 咖n e d i a t e l yq l l a m i f i e db yl l s i n gL e i c aT C SS PS p e c t r a lC o n 舭a lM i c r o s c o p c R 髂u l b1 A 舭re
16、 x p o s W eo f 小E C st oH c ya t l 如c o n c e n 咖i o no fO 5m m o 扎f o rd i 位r e n tt i I n e ，c d lv i a b i l 毋、嬲n oc I 瑚1 9 e ；t 1 1 e c r e t i o no fI c 舢- 2 凹慨i nw 船l l 讪c r 啪t l l o s eo f m ec o n 们lg r o u pa t 恤t i I n eo f l 2h U 0 5 ) ，趾d w 器s i 卿f i c 孤u y l l 诎c ra t 也e 缸eo f 2 4h 如d4 8h ( p ( o 0 1 ) ；T h ee x p r e s s i o no f I C W 2p r o t e i
