《2017高中生物dna和蛋白质技术5.3血红蛋白的提取和分离课件7新人教版选修120170823432》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2017高中生物dna和蛋白质技术5.3血红蛋白的提取和分离课件7新人教版选修120170823432（36页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 本课题学习目标本课题学习目标体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并 了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1 1、主要概念：、主要概念：凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在 血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.2. 主要原理：主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理3 3、课题重点：、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4 4、课题难点：课题难点：样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。1.分离生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 。2.蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质各种特
2、性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多 少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的 蛋白质。一、血红蛋白的提取和分离3、提取分离方法凝胶色谱法 凝胶电泳法 （一） 凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内 部有许多贯穿的通道。根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结 构的凝胶，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进 入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部
3、移动 ，路程较短，移动速度较快。依据的特性是：蛋白质分子量的大小。4. 4.凝胶色谱法凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示（二）缓冲溶液1.概念:在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强 酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混 合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响， 维持PH基本不变。2.作用:思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3通常由12 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得 在不同PH范围内使用的缓冲液。4.提问：在本课题中
4、使用的缓冲液是:_ ,利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液3.缓冲溶液的配制:其目的是:（三）（三） 电泳：电泳： 1. 1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH 下，这些基团会带上正 电或负电。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使 带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。影响蛋白质分子运动速度的因素决定 运动方
5、向形成 库仑力形成 阻力决定 运动速率 电荷性质 电荷量分子形状 分子大小3.3.类型类型: :琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。在在电场电场的作用下，的作用下，这这些些带电带电分子分子会会向着向着与与其所其所带电带电荷相反的荷相反的电电极极移移动动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳1、测定蛋白质分子量:常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化 剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺
6、的交联共聚反应蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。2.原理：SDS能使蛋白质发生完全变性。解聚成单条 肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。 SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物， SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有 的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差 别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3. SDS作用机理:用SDS测定蛋白质分子量的方法使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋 白质的分子量时，可选用一组已知分子量 的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子 量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定 未知蛋白质的分子量。市场上有高分子
7、量 、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂 出售。二、实验操作样品处理粗分离纯化纯度鉴定1.样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。血液血浆水 分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞 （最多）血红蛋白 （90）两个肽链两个一肽链四个亚铁血红素基团2.提问：血液有哪些成分？1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是 什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细 胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白两个肽链两个一肽链四个亚
8、铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团， 此基团可携带一分子O2或一分子CO2 ，血红蛋白因含有血红素而 呈红色。血红蛋白的特点：(1)红细胞的洗涤:去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化.1、采集血样 2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果） 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。 4、盐水洗涤：下层暗红色的红细胞+五倍体积的0.9的NaCl溶液洗涤，搅拌10min 5、低速短时间离心： 6、重复3、4、5步骤三次上清液中已没有黄色：红细胞洗涤干净。目的:操作：洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。(2)(2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血
9、液体积，加40体积的甲苯 （溶解细胞膜）置于磁力搅拌器搅拌10min（加速细胞破裂）红细胞破裂，释放出血红蛋白(3)分离血红蛋白溶液：过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速 度离心10 min。试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）； 第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）； 第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）； 第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离： 滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层， 分液漏斗中静置：分出下层的红色透明液 体。甲苯层（无色透明） 白色薄层固体 红色透明液体杂质沉淀层（暗红色） 试管中溶液层次(4)透 析：过
10、程： 取1ml的血红蛋白溶液装入透 析袋中，将透析袋放入盛有 300ml的20mmol/l的磷酸缓冲 液中（pH为7.0），透析12h目的： 除去样品中分子量较小的杂质和离子。 或用于更换样品的缓冲液。20mmol/L磷酸缓冲液1mL透析过程动画演示透析过程动画演示2.凝胶色谱操作: （1）凝胶色谱柱的制作：取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端磨平。 底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用 100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：玻璃管的 上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会 导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 顶塞的制作：打孔安装玻璃管。 组装：
11、将上述三者按相应位置组装成一个整体。 安装其他附属结构。（2）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择： A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀注意：1、装填时尽量紧密：降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的
12、洗脱次序 ，降低分离效果。洗涤平衡：连接缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml 的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡 12h。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入， 影响分离效果2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填50cm50cm高高（3）样品加入与洗脱调节缓冲液面：打开下端出口，使缓冲液下降到与凝胶面平齐，关闭出口 滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，注意： 1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样3、吸管管口贴着管壁环绕移动加样 样品渗入凝胶床：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，样
13、品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 洗脱：加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。 （如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管 口沿管壁环绕移动。思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对
14、你进行血红蛋白的 分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收 集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 血红蛋白提取和分离的程序包括： 样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。样品的处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，样品的粗分离:透析去除分子量较小的杂质样品的纯化：凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质蛋白纯度鉴定:聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？（三）（三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）2. 2.试剂的配制：试剂的配制：鉴定
15、血红蛋白纯度。1. 1.目的：目的：3.方法步骤：（略）观察处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显， 可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞 一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取 纯度。三、实验结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗 ？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判 断的？1、由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放 一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。2、加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色 葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平 整，说明凝胶色谱柱的性能良好。3、色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡， 消除不了时要重新装柱。 红色区带：均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；说明凝胶色谱柱装填得很成 功、分离操作也正确红色区带：歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关 。3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动 情况，并据此判断分离效果？
