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1、维化的作用，对四氯化碳体外损伤肝细胞有保护作用。但其抗纤维化作用的具体环节和机制仍需进一步探明。肝星状细胞活化为肌成纤维细胞样细胞是非正常细胞外基质的主要来源，而这些非正常细胞外基质是疾病进程的生化标志。肝纤维化是肝硬化的前期病变，是可逆的，无假小叶形成，是治疗的重要时期。丹酚酸J T C M J u n e2 0 0 6 ，V 0 1 4 7 ，S u p p l e m e n tB 的抑制增殖作用，对于肝纤维化的防治有重要意义。从实验结果可以看出，l t L M 和I O t L M 的丹酚酸B 显著抑制体外培养原代H S C 的增殖。*上海中医药大学( 2 0 1 2 0 3 )生地注
2、射液对大鼠肺间质纤维化过程中 M C P 一1m R N A 表达的影响凌霞+毕小利。张炜。近年来，越来越多的学者认为细胞因子在肺纤维化的发生发展中起着关键的作用，并认为肺纤维化可能是由于I 型T 细胞( T h l ) 与型T 细胞( T h 2 ) 因子之间失衡，导致以型细胞因子反应为主，而引起纤维化。M C P 一1 ( 单核细胞趋化蛋白1 ) 为型细胞因子之一，实验研究表明，M C P 一1 可以显著刺激肺成纤维细胞合成胶原，对肺纤维化的形成有促进作用。故此我们在以往实验研究的基础上选择具有滋阴养血功效的地黄制剂，观察其对实验性大鼠肺纤维化过程中M C P 一1 的影响，并初步探讨其内
3、在机理，为中药治疗肺纤维化提供实验线索。1材料1 1 动物：雄性S D 大鼠9 6 只，体重( 2 0 0 - 4 - 2 0 9 ) ，上海必凯动物实验中心提供，清洁级，许可证号：S C X K( 沪) 2 0 0 3 0 0 0 2 。1 2主要药品及试剂：生地注射液1 0 m l 支( 含生药2 9 ) 曙光医院制剂中心提供，批号：0 3 0 9 1 0 ；注射用盐酸博莱霉素1 5 m g 瓶，日本化药株式会社生产，批号：4 3 2 3 5 0 ；甲强龙干粉剂4 0 m g 瓶，法玛西亚普强公司卡拉玛祖分厂生产，批号：3 0 J T B 。总R N A 提取试剂盒，美国I n v i t
4、 r o g e n 公司，批号：1 1 6 1 6 3 4 。引物购自上海博 亚生物技术有限公司，M C P l 有义链为5 一A T G C A G G T C T C T G T C A C G 3 ；反义链为5 一 C T T C T G G A C C C A T T C C T T A T T G G - - 3 。内参照pa c t i n ( 肌蛋白) ，其有义链为5 一A T G G A T G A C G A T A T C G C T G 一3 ；反义链为5 一A T G A G G T A G T C T G T C A G G T 一3 。所需试剂购自美国P r o
5、m e g a 公司：5 xR e a c t i o nB u f f e r 批号：3 0 7 0 3 1 ；M I 。V反转录酶，批号：0 0 4 1 2 1 。 2 方法2 1模型的制备：参照文献方法进行，即采用盐酸博莱霉素气管内注入法复制大鼠肺间质纤维化模型，以第7 天动物出现毛无光泽、竖毛、反应迟钝、体温下降、体重增长缓慢或下降、蜷缩等现象认定模型制作成功。2 2 实验动物的分组与处理：雄性S D 大鼠，购回后于室温2 0 。C ，自然光照条件下适应性饲养1 周( 曙光医院动物房) 。随机分成对照组( C o n t r 0 1 ) 、模型组( M o d e l ) 、生地组(
6、S D ) 、甲强龙组( J Q L ) 各2 4 只。模型组、生地组、甲强龙组分别按上述模型制备法于气管内注入盐酸博莱霉素，对照组气管内注入同等剂量的注射用水以作对照。造模后第1 天起，对照组和模型组每日予以注射用水2 m l 腹腔注射，致处死日。生地组按体重每日予生地注射液1 0 m l k g 。d ，腹腔注射，至处死日。甲强龙组造按体重每日予以甲强龙注射液2 m lk g 。d ，腹腔注射，至处死E l 。各组动物分别于造 模后第3 天，第7 天及第2 8 天随机处死8 只。两肺冲洗后称重，计算肺系数。右肺置于5 m l 离心管中，置于4 。C 冰箱保存，然后置于一7 0 。C 冷柜，
7、待提取m R N A 。2 3 实验动物用药量的确定：参照文献以成人剂量的6 倍计算后，均用注射用水稀释至2 m l 。2 4R T P C R2 4 1t u R N A 的提取：采用总R N A 提取试剂盒( 美国I n v i t r o g e n 公司) R N A 提取方案。2 4 2C D N A 的合成：5 0 t A 反应体积含1 0 u l 浓度为l u g p l 的R N A ，0 1 D E P C H 2 02 3 p 1 ，o l i g i o ( d T )3 u l 置6 5 水浴l O m i n ，加入5 xR e a c t i o nB u f f
8、e rl O r d ，2 5 m m o l I 。d N T P2 u l ，l u l4 0 U u lt u R N A 抑制剂和l u l2 0 0 U u l M l 。V 反转录酶，反应混合物在3 7 孵育9 0 r a i n 。2 4 2P C R 反应：2 5 u l 反应体系含相应引物的反应液2 0 u l ( 1 0 P C R 缓冲液) ，T a q D N A 聚合酶l u l 和2 u l反转录产物，9 4 预变性5 m i n ，然后9 4 4 0 s ，5 5 l m i n ，7 2 C9 0 s ，7 2 延伸5 m i n ，于P C R 扩增仪( P
9、e r k i nE l m e r2 4 0 0 扩增仪) 扩增共3 0 个循环，每一样中医杂志2 0 0 6 年6 月第4 7 卷增于| ! |本体系同时扩增M C P 一1 和p 一( 肌蛋白) a c t i n 的c D -N A ，产物片断分别为2 5 5 b p 和5 9 9 b p 。2 4 3 电泳：于2 琼脂糖凝胶( 含0 5 肛g m l 溴化乙锭) 中电泳，G I S 一2 0 1 0 凝胶成像及分析系统下扫描分 析，M C P l m R N A 的相对含量用M C P 一1 与p a c t i n 吸光度与面积之比值表示。2 5 统计学方法：结果采用互s 表示，组
10、间差别采用单因素方差分析，L S D 两两比较检验。应用S P S S1 1 5 统计软件。3结果3 1 体重及肺系数观察：表1 示第2 8 天大鼠体重上升，生地组体重高于模型组，说明治疗有助于体重的恢复。第3 、7 、2 8 天S D 组的体重均值均高于J Q L 组说明生地注射液可能有助于急性肺损伤大鼠体重的恢复，虽无统计学差异，可能与样本量较小有关。经治疗后第2 8 天，J Q L 组、S D 组肺系数降低，与对照组已无明显差异，由此说明甲强龙及生地注射液均有助于肺纤维化的改善，第2 8 天效果最为显著，且两组无明显差异。第3 、7 天J Q I 。组、S D 组体重较模型组下降而肺系数
11、较之升高，可能由于治疗方式引起机体不适应所致，或者药物对肺纤维化形成早期的治疗作用又一定的局限性，而对远期恢复效果较好( 表2 ) ，其机理有待于进一步实验证明。表14 组动物体重观察( g ，i 士s )与C o n t r o l 组比较，# P 0 0 5 ；与M o d e l 组比较，* P 0 0 5袭24 组动物肺系数观察( ；土s )与C o n t r o l 组比较，# P 0 0 5 ；与M o de l 组比较，* P O 0 53 2M C P 一1m R N A 的表达：表3 示，第3 天M o d e l组与C o n t r o l 组M C P - - l m
12、 R N A 的表达有显著差异( P o 0 5 ) ，说明肺纤维化急性期，M c p l m R N A 升高。 第7 天4 组M C P l m R N A 表达均升高，达到高峰，J Q I 。组与S D 组均低于模型组( 无统计学差异) 。第2 8天总体M C P l m R N A 均下降，可能由于样本量太小，无统计学意义，但从数值来看模型组仍最高，S D 组低于J Q I 。组。表3 运用R T - - P C R 方法测得M C P 一1m R N A 的表达( i 土s )与C o n t r o l 组比较，# P O 0 5 ；与M 0 d e l 组比较，* P 0 0 5
13、 4 讨论肺纤维化的发病甚为复杂，其大致过程可以概括为肺泡炎、肺实质损伤和修复或纤维化。肺间质纤维化主要表现为咳嗽、咯痰，后期出现进行性加重的呼吸困难，同时又有慢性或反复发作的特点，故中医学将其归入“肺痿”的范畴。张仲景在金匮要略肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七中指出“热在上焦者，因咳为肺痿，肺痿之病或从汗出，或从呕吐，或从消渴，小便利数，或从小便难，又被快药下利。重亡律液，故得之。”肺痿发病多因“重亡津液”为本。西医治疗肺纤维化的首选药物是皮质激素，其次是细胞毒药物和免疫抑制剂。但疗效不理想，且长期使用副作用较大，患者难以坚持治疗。生地注射液可以改善I P F 病理形态，改善胶原代谢和对氧自由基
14、的清除能力，抑制细胞因子T G F B ，从而减少C o l 噩的异常沉积，改善肺纤维化的形成。因此，我们选择了具滋阴清热，养血生津功效的生地，经乙醇提取制成注射液，观察其对实验性肺纤维化M C P 一1 m R N A 的表达水平的影响。本实验结果表明，模型组M C P l m R N A 的表达在肺纤维化过程中增加，第7 天时达到高峰，模型组 M C P 一1 含量高于对照组( P 0 0 5 ) ，与K e r m a n i 的研究一致，而2 8 天时已有回落。甲强龙和生地组第7天时M C P 一1 低于模型组，可能是通过其抑制炎性细胞因子的释放，抑制成纤维细胞的活化和增殖而发挥作用，进而延缓肺纤维化的进程。本实验还观察到，大鼠气管内注入博来霉素后，第7 天时均有不同程度的毛发稀疏、精神不振、活动及觅食减少，体重明显下降等症状，生地注射液组各方面优于甲强龙组。综上所述，生地注射液对肺纤维早期M C P l m R N A 的表达有一定的抑制作用，从而可能延缓肺纤维化的发展。生地注射液副作用小，并可拮抗长期使用激素所带来的不良反应，因此，可配合西药治疗，为临床治疗肺纤维化提供了实验线索，但其内在机理还有待于进一步探讨。*上海中医药大学附属曙光医院( 2 0 0 0 2 1 )
