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1、第一军医大学2 0 0 2 级博士学位论文矿8 183S6牛磺酸对照射后成年大鼠海马齿状回神经元再生的影响T h ee f f e c to ft a u r i n eo nr a d i a t i o n - a r r e s t e dN e u r o g e n e s i si nt h ed e n t a t eg y r u so fa d u l tr a th i p p o c a m p u s课题来源：自选课题专业名称放射肿瘤学 学位申请人邱幸生指导教师陈龙华教授答辩委员会主席答辩委员会成员论文评阅人庄承海教授庄承海教授崔念基教授陈应瑞教授陈永清教授闫卫平教授曾
2、建华教授袁亚维教授李伟雄教授夏云飞教授吴中海教授2 0 0 5 年5 月1 0 日广州博士学位论文牛磺酸对照射后成年大鼠海马齿状回 神经元再生的影响博士研究生：邱幸生指导教师：陈龙华摘要研究背景颅脑照射是脑与头颈部原发性及继发性恶性肿瘤常用的放射治疗技术，是达到肿瘤局部控制的必要手段，有利于提高治愈率。颅脑照射可能损害神经组织结构与功能，甚至导致脑组织坏死。有些患者于颅脑照射后数月至数年，发生认知障碍，表现为海马依赖性功能的进展性损害，在学习、记忆与空问信息处理方面发生缺陷，严重时表现为痴呆。认知障碍是照射后最常见的晚期毒性反应。儿章是脑肿瘤及血液系统恶性肿瘤脑浸润的高发人群，常需接受颅脑照射
3、，而儿童神经组织对放射损伤尤为敏感，照射后可能发生进展性认知障碍。颅脑照射后发生的认知障碍严重损害患者的生活质量，给其家庭与社会带来巨大心理与经济负担，是严重的社会问题，受到医学界的广泛关注。临床观察结果表明，认知功能损害的严重程度与内侧颞叶受照射剂量相关，可能与海马结构的功能受到损伤有关，而多数认知功能缺陷的患者行脑组织学检查却没有明显病理学变化，如血管损伤、脱髓鞘变性或坏死，提示照射后存在更加隐匿的病变过程，损害正常的神经认知过程。最近，有学者认为，照射后海马齿状回神经元再生抑制与照射后认知障碍有关。成年哺乳动物大脑中存在两个神经元再生活跃区域，即海马齿状回颗粒下层( s u b g r
4、a n u l a r z o n e ，S G Z ) 与侧脑室的脑室下区( s u b v e n t r i c u l a rz o n e ，s v z ) ，终生有神经元再生。在啮齿类动物与灵长类动物海马结构中，由颗粒下层的神经前体细胞产生新生神经细胞，移行到颗粒细胞层，表现颗粒细胞层细胞的形态中文摘要学特征，并表达神经元标志，I j C A 3 区发出轴突。新生神经细胞有静息膜电位、动作电位及功能突触，具备成熟的齿状回颗粒神经元的电生理学特征，刺激穿透路径可诱发新生神经细胞膜电位活动，提示新生神经细胞已经分化为神经元，完全功能性整合到海马回路中。用海马脑片模型，发现放射抑制齿状回
5、神经元再生后，长时程增强( 1 0 n g - t e r mp o t e n t i a t i o n ，L T P ) 受到抑制，表明新生神经元参与突触可塑性形成，而通常认为，突触可塑性是学习与记忆的神经基础。新生神经元与神经认知过程相关，富集环境或训练可促进神经元再生，而新生神经元数量增加与记忆力提高及突触可塑性增强相关。用细胞毒性药物M A Y( 乙酸甲基氧化偶氮甲醇) 或照射方法清除新生神经元，则海马依赖性痕跻记忆眨眼傺件反射及空间识别功能受到损害。幼鼠全脑照射后3 个月，新生神经元数量减少，同时伴随空间记忆功能缺陷，提示神经元再生有可能在部分海马依赖性学习功能中起重要作用。增殖
6、细胞较非增殖细胞对射线更加敏感，照射能杀伤或阻滞增殖期细胞。受照射后，大鼠颗粒下层增殖细胞发生凋亡，数个月后，增殖细胞数量仍然减少。单次照射l O G y 齐l J 量，2 个月后，神经元再生几乎完全消失，增殖的神经前体细胞主要向胶质细胞分化。照射既可导致神经增殖细胞数量减少，也可使神经增殖细胞向神经元分化比例减少。照射后分离细胞前体细胞行体外培养的实验证实，照射于短期内没有清空神经前体细胞，而可阻滞神经前体细胞的分裂过程，使神经前体细胞向神经元分化的比例减少，其原因可能与神经前体细胞D N A受到损伤，神经前体细胞分化微环境受到破坏有关。照射后，神经元再生区域内激活的小胶质细胞数量增多，炎症
7、反应抑制神经元再生；另外，神经再生与血管再生间关系发生异常，增殖神经细胞与微血管的距离增加，新生内皮细胞对增殖细胞的支持作用减弱。因此，恢复神经元再生的策略包括两方面：1 ，补充照射后丧失的神经前体细胞；2 ，修复神经元再生微环境；前者常用方法为神经前体细胞移植，后者关键在重建使神经前体细胞向神经元分化的微环境。博士学位论文牛磺酸是一种抑制性氨基酸，是体内含量最丰富的非必需氨基酸，具有稳定细胞膜，调节渗透压的作用，作为神经调质与神经递质，降低胞外过高谷氨酸引起的毒性，抑制细胞内钙浓度过分升高，稳定细胞内钙，在多种神经组织受损伤过程中发挥保护作用，对牛磺酸在放射性脑损伤中的作用，尚未见报道。目的
8、本实验拟观察照射对大鼠海马齿状回神经元再生及大鼠行为学的影响，观察牛磺酸对照射后神经元再生抑制有无逆转作用，为临床防治放射性脑损伤提供理论依据。材料与方法1 大鼠全脑照射方法成年雄性W i s t a r 大鼠，体重2 0 0 2 0 克，由第一军医大学实验动物中心提供。大鼠经1 0 水合氯醛麻醉( 按3 5 m l k g 腹腔注射) 后，俯卧固定于直线加速器( 美国V a r i a n6 0 0 C ) 治疗床上，表面垫2 c m 厚有机玻璃板。源皮距1 0 0 c m ，照射野大小为2 c m X 3 c m ，光野前界位于双眼后眦连线，后界位于双耳后连线，左右落空。吸收剂量率为2 G
9、 y m i n ，参考深度为皮下0 5 c m ，照射组吸收剂量为1 0 G y ，对照组只麻醉而不作照射。2 脑取材及冰冻切片的制备大鼠以1 0 水合氯醛麻醉( 按3 5 m l k g 腹腔注射) 后，经左心室穿刺至主动脉，同时剪开右心耳，先以生理盐水2 0 0 m l 冲管，继以0 1 MP B S 液、4 H C H 0 ( p H 7 2 7 4 ) 4 0 0 m l 灌注，先用1 5 0 m l 快速灌注，再用2 5 0 m l 缓慢滴注，持续2 h ，去除颅骨，取脑，修块，放入4 甲醛溶液中4 6 h ，然后取出脑组织块，放入3 0 蔗糖溶液中饱和2 4 4 8 h ，沉底后
10、取出，在恒冷冰冻切片机L e i c aC M l 8 5 0 上，取大鼠脑b r e g m a 一3 1 4 m m 一4 5 2 r a m 连续行冠状断面冰冻切片，厚度为1 0 u m 或3 0 u m ，放置于一2 0 冰箱中，备用。1 0 u m 的切片用于T u n n e l 染色、免疫组化，3 0 u m 用于飘浮法免疫组化。3 B r d u ( 5 - 溴脱氧尿苷) 与牛磺酸腹腔注射方法I I l中文摘要为标记增殖细胞及定量增殖细胞分化为神经元比例，于大鼠全脑照射后1月，正常组与照射组大鼠均按7 5 m g k g 体重给予B r d u ( 生理盐水溶解) 腹腔注射，2
11、 次日，间隔8 h ，连续给药2 天，于给药后4 周，处死大鼠，灌注固定后取脑。为观察牛磺酸对大鼠放射性脑损伤影响，于照射前l 周按1 0 0 m g k g 体重腹腔注射牛磺酸，1 次天，连续2 周。4 组织学检查T U N E L 标记根据试剂盒( 货号$ 7 1 0 0c h e m i c o n ) 说明书提供的T u n e l 标记操作程序，略作改迸。1 0 u m 厚冠状冰冻切片，微波中火5 分钟，自然冷却，P B S 液重新水化，用3 O H 。o 。甲醇灭活内源性过氧化物酶l O 分钟，P B S 液漂洗后，加入平衡缓冲液孵育3 0 分钟，力N 5 5 u l 5 c m
12、2 的W o r k i n gs t r e n g t hT d Te n z y m e ，3 74 C 孵育6 0 分钟，然后加终止缓冲液孵育1 0 分钟，自H a n t i d i g o x i g e n i np e r o x i d a s ec o n j u g a t e 孵育3 0 分钟，用P B S 冲洗，滤纸吸取标本周围的水分后，加入0 0 2 D A B 显色液，室温下染色3 分钟，置0 ，5 甲基绿染色缸中复染1 0 分钟。B r d U 或n e s ti n 的免疫组织化学标记3 0 u m 厚冠状冰冻切片，置6 5 内含5 0 f o r m a m
13、 i d e 甲酰胺、2 8 0 n d dN a C l 及3 0 m M柠檬酸钠的混合溶液中孵育2 h ，在2 NH C l3 7 。C 孵育3 0 m i n ，室温下在0 1 M 硼酸液中( P H8 5 ) 漂洗l O 分钟，1 H 。0 。P B S 溶液封闭1 5 分钟，加2 正常羊血清封闭液( 内含0 3 T r i t o n i 0 0 ) ，室温下封闭2 h ，然后加入一抗。B r d U 的免疫组织化学标记加小鼠抗B r d U ( 2m g m l ，R o c h e ) ，n e s t i n 的免疫组织化学标记加小鼠抗大鼠n e s f i n 抗体( 1 ：
14、i 0 0 0c h e m i c o n ) ，置4 过夜，P B S 液漂洗后，加生物素标记的羊抗鼠二抗溶液( 1 ：2 0 0 ) 中、3 7 。C 下孵育3 0 m i n ，3 7 。C 下在S A B C 溶液中孵育3 0 r a i n ，用D A B 反应液显色。B r d U 与N e u N 双染标记法3 0 u m 厚冰冻切片，在2NH C l 溶液中孵育1 h ，用5 B S A 液封闭l h ，在经血清稀释液稀释的N e u N 一抗( m o u s ea n t i - r a t1 ：1 0 0 ，C h e m i c o n ) 中孵育( 每张切片博士学位
15、论文5 0 8 0 u l 或2 5 0 u l 孑L ) ，置4 过夜，后在3 7 。C 下孵育3 0 分钟，加经F I T C 标记的羊抗鼠( J a c k s o nI m m u n o R e s e a r c h ：1 ：2 0 0 ) 溶液，室温下孵育6 0 分钟，在2 NH C l3 7 。C 下孵育1 2 0 分钟，力N D o n k e y 血清封闭2 h ，加经血清稀释液稀释的s h e e pa n t iB r d u 一抗( 2 5 u g m 1 ，B i o D e s i g n ，N e wY o r k ) 中孵育( 每张切片5 0 8 0 u l
16、或2 5 0 u l 孔) ，置4 过夜，后在3 7 。CF 孵育3 0 分钟，加经R h o d a m i n e 标记的D o n k e ya n t is h e e p ( 1 ：2 0 0 ，j a c k s o ni m m u n o r e s e a r c h ) 溶液，室温孵育6 0 分钟，在荧光显微镜下观察荧光分布，捡钡J J r h o d a m i n e 的激发发射光波长为5 3 5 5 6 5n n l ，F I T C 荧光的激发发射光波长为4 7 0 5 0 5n l n ，计数双染阳性细胞数占B r d u 单染阳性细胞数的比例。行为学试验旷场试验( o p e nf i e l d 法) 本实验采用敝箱为立方体，高为4 0 c m ，长宽各为8 0 c m ，周壁为黑色，底面由面积相等的2 5 块组成。以动物穿越地面块数为水平活动得分( c r o s s i n g ) ，动物穿越1 格为1 分。以直立次数为垂直
