硬脂酸镁的微生物限度检查

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1、硬脂酸镁的微生物限度检查一、 概述本报告按 USP31 中“ 61-62非灭菌产品的微生物学检查”的规定，对硬脂酸美的微生物学检查方法学考察。 参照企业提供标准， 通过测试实验制定适合于本品的微生物学检查的方法。企业提供标准：总需气菌数（ TAMC）不得过 1000 cfu/g；霉菌及酵母菌总数（TYMC ）不得过500 cfu/g；每 1g 样品不得检出大肠埃希菌；每10g 样品不得检出沙门氏菌。二、 方法学1、 培养基及试剂实验用培养基及缓冲液均符合USP规定。BP：pH7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液CA：溴化十六烷基三甲铵MCA ：麦康凯琼脂MCB：麦康凯肉汤MSA：甘露醇盐琼脂RVS：RV

2、 沙门菌增菌肉汤SDA：沙氏葡萄糖琼脂SDB：沙氏葡萄糖肉汤TSA：大豆胰酪胨琼脂TSB：大豆胰酪胨肉汤XLD ：赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂2、 实验菌株黑曲霉ATCC16404 枯草芽孢杆菌ATCC6633，CMCC(B)63501 白色念珠菌ATCC10231，CMCC(F)98001 大肠埃希菌ATCC8739 铜绿假单胞菌ATCC9027 霍乱沙门氏菌ATCC14028 金黄色葡萄球菌ATCC6538，CMCC(B)26003 本实验取用中国临床医学菌种保存中心（CMCC）的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌。这三株菌也来源于ATCC。实验用菌株，自种子批启用传代不超过 5 次。黑曲霉

3、为 3 个月内制得的 4保存的孢子悬液，可直接稀释使用。参照表格2，将其他6 株菌分别接种至规定的培养条件培养。上述各菌分别以pH7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液10 倍稀释至大约 50-100 cfu/mL 的浓度，备用。参照表格 2 各菌株的生长条件，采用浇碟法测定稀释得到的最终菌液浓度。3、 方法学本部分主要包括培养基特性测试和方法的适用性考察。3.1 培养基特性测试按照 USP31 中“ 61-62非灭菌产品的微生物学检查”的规定，与已经通过测试验证的参比培养基（ M）相比，当微生物限度检查用培养基（M）符合以下标准，则用于硬脂酸美的微生物学检验：a. 固体培养基的促生长能力：与M相比，M的

4、回收率应在50%-200%之间。b. 固体培养基指示能力： 与 M相比，规定菌株在 M的生长特征应与之类似。c.液体培养基促生长能力：与M相比，规定菌株在M有明显浑浊。d. 抑制能力：无论是固体培养基或是液体培养基，规定菌株在其不得生长。对于固体培养基， 通常采用平皿计数法 (包括浇碟法和表面接种法)来评价培养基特性， 每次平行测试两皿， 最后取平均数为计算结果。 培养基特性测试结果见表格 3-表格 5。3.2 方法适用性当微生物学检查方法符合以下要求时，说明该方法适用该品种：a.样品供试液不得抑制测试菌株的生长。计数实验中，测试微生物在供试样品中的回收率不得低于接种量的50%；控制菌检查中，

5、 测试菌在含有规定量供试品的环境中应可以生长。b.样品自身含有的微生物水平不得干扰菌株回收实验。供试液制备：以 70%的乙醇擦拭供试品的外包装， 使自然挥干。由于硬脂酸美是一种脂溶性物质，因此用表面活性剂吐温-80 将其溶解。无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶，加入一定量的45灭菌的含 1%吐温-80 的 pH7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液，振摇使分散均匀，制成1:40 的供试液。计数方法适用性：a.实验组：取 4 个直径为 9cm 的无菌平皿。其中两个平皿中加入1:40 供试液4mL 和 50-100cfu 测试菌，取另两平皿加入1:40 供试液 2mL 和 50-100cfu 测试菌。

6、每个平皿倾注45表格 2 中的规定培养基，摇匀。待琼脂凝固后，参照表格 2 的条件倒置培养。 5 株测试菌（黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌）均进行该测试。b.样品组：取 8 个直径为 9cm 的无菌平皿。其中两个平皿中分别加入1:40 供试液 4mL 和 2mL，每个平皿倾注45 TSA；取另两平皿加入1:40 供试液 4mL和 2mL，每个平皿倾注 45 SDA；各平行测试两皿。参照表格2 培养。记录平皿计数结果，计算测试菌回收率。c.菌液组：计数方法适用性检查中测试菌包括5 株测试菌，分别为黑曲霉、枯草芽孢杆菌、 白色念珠菌、 铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

7、参考表格 2 培养条件，采用浇碟法计数，确定接种量。d.回收率计算公式如下：100%CB-A回收率A-实验组平均菌落数； B-样品组平均菌落数； C-菌液组平均菌落数。控制菌测试方法适用性：大肠埃希菌a. 预培养：取 1:40 供试液 40mL（相当于 1g）至 400mL 灭菌 TSB，混匀，置30 至 35培养 18 至 24 小时。b. 阳性组 1：接种 50-100cfu 大肠埃希菌至灭菌TSB 中，置 30 至 35培养 18至 24 小时。c.实验组 1： 取 1:40 供试液 40mL （相当于 1g） 和 50-100cfu 大肠埃希菌至 400mL灭菌 TSB，混匀，置 30

8、至 35培养 18 至 24 小时。d. 阳性组 2： 取 1mL 灭菌 TSB 和 50-100cfu大肠埃希菌至 100mL 灭菌麦康凯肉汤中，置 42 至 44培养 24至 48 小时；划线接种至麦康凯琼脂，30 至 35培养 18 至 72 小时。e. 实验组 2： 取 TSB 预培养物 1mL 和 50-100cfu 大肠埃希菌至 100mL 灭菌麦康凯肉汤中，置 42 至 44培养 24 至 48 小时。划线接种至麦康凯琼脂，30至35培养 18 至 72 小时。沙门氏菌a. 预培养：无菌操作取10g 硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶，加入45的400mL1%吐温-80 的灭菌 TSB，

9、振摇使分散均匀， 置 30 至 35培养 18 至 24小时。b. 阳性组 1：接种 50-100cfu 霍乱沙门氏菌至灭菌的1%吐温-80 的 TSB 中，置30 至 35培养 18 至 24 小时。c.实验组 1： 无菌操作取 10g 硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶， 加入 45的 400mL灭菌的 1%吐温-80 的 TSB，振摇使分散均匀。加入50-100cfu 霍乱沙门氏菌置 30 至 35培养 18至 24 小时。d. 阳性组 2：取 0.1mL 灭菌 TSB（含 1%吐温-80）和 50-100cfu霍乱沙门氏菌至10mL 灭菌 RVS肉汤中， 30至 35培养 18 至 24小时；

10、划线接种至XLD 琼脂，30 至 35培养 18 至 48 小时。e. 实验组 2：取 TSB（含 1%吐温-80）预培养物 0.1mL 和 50-100cfu 霍乱沙门氏菌至 10mL 灭菌 RVS肉汤中， 30 至 35培养 18 至 24 小时； 划线接种至 XLD琼脂， 30 至 35培养 18 至 48 小时。4、 讨论表格 3 至表格 5表明本品涉及到所有培养基均符合微生物学检查用的要求。培养基的灭菌方式各异，参见表格1。表格 6 至表格 8 表明硬脂酸美并不抑制各株测试菌的生长。 计数实验中， 胶囊壳自身的颜色使得琼脂清晰度降低，使得对3 株细菌（枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄

11、色葡萄球菌）的计数较为困难，但并不影响黑曲霉和酵母菌的计数。因此，通过方法适用性实验， 确定以增加培养基体积的方式使得平皿计数可行。控制菌检查方法依照常规方法即可满足。本品微生物学检查方法的具体内容在后续细述，详见“微生物学检查检验操作程序” 。三、 微生物学检查检验操作程序1、 供试样品制备以 70%的乙醇擦拭供试品的外包装，使自然挥干。无菌操作取10g 硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶，加入的45含 1%吐温-80 灭菌 pH7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液，振摇使分散均匀，制成1:40 的供试液。取 1:40 供试液 4mL 至 6mL pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，制得1:100 供试液。2、 计

12、数测试实验中均使用直径为9cm 的灭菌平皿。a. 需气菌计数（ TAMC） ：取 1:40 供试液 2mL，平行测定 4 皿；取 1:100 供试液1mL，平行测定 2皿，分别倾注 15-20mL45 TSA 琼脂，充分摇匀分散供试品。待平皿中琼脂凝固后， 30-35倒置培养 3 至 5 天。b. 霉菌和酵母菌计数 （TYMC ） ：取 1:40 供试液 2mL，平行测定 4 皿， ；取 1:100供试液 1mL，平行测定 2 皿，倾注 15-20mL45 SDA 琼脂，充分摇匀分散供试品。待平皿中琼脂凝固后，20-25倒置培养 5 至 7 天。按照规定培养条件结束培养后，点击平皿中的菌落数（

13、CFU） 。通过平皿计数结果求算均值， 最后转换为相当于每g 样品中含有的菌落数。 若样品中未检出菌落，则结果可解释为“每g 样品中菌落数少于10 个。 ” 。3、 控制菌检查3.1 大肠埃希菌取 1:40 供试液 40mL（相当于 1g）至 400mL TSB，混匀，置 30 至 35培养 18至 24 小时，观察结果。取TSB 培养物 2mL 接种至 100mL 麦康凯肉汤，置42至 44培养 24至 48小时，观察结果并划线接种至麦康凯琼脂，置 30 至 35培养 18 至 72 小时，逐日观察结果。3.2 沙门氏菌无菌操作取 10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶， 加入 400mL 的 4

14、5灭菌 TSB （含1%吐温-80） ，振摇使分散均匀，置30 至 35培养 18 至 24 小时，观察结果。取0.1mL TSB 培养物接种至 10mLRVS 肉汤，置 30至 35培养 18 至 24 小时，观察结果并划线接种至XLD 琼脂，置 30 至 35培养 18 至 48 小时，逐日观察结果。4、 阴性对照实验设置阴性对照组， 以确证实验操作条件的可靠性。 阴性对照操作同上述操作过程，其中以稀释剂代替供试品同步操作。表格: 表格 1 : 培养基来源信息参比培养基测试用培养基灭菌条件厂家批号厂家批号 BP / / 美坛090205 121, 15min MCA NICPBPDCM00

15、08 美坛070124 121, 15min MCB NICPBPDCM0013 美坛080321 121, 15min RVS NICPBPDCM0003 Merck VM855366721 115, 15min SDA NICPBPDCM0005 美坛070315 121, 15min SDB NICPBPDCM0001 美坛090209 121, 15min TSA NICPBPDCM0002 美坛080701 121, 15min TSB NICPBPDCM0011 美坛090414 121, 15min XLD NICPBP DCM0012 BD 7088156 Heat to bo

16、iling 表格 2 : 测试用菌株生长条件测试用菌株菌株复苏用 培养基计数用培养基培养温度培养时间黑曲霉/ SDA 20-255-7days 枯草芽孢杆菌TSB TSA 30-353-5days 白色念珠菌SDB SDA 20-255-7days 大肠埃希菌TSBTSA30-353-5days 铜绿假单胞菌TSBTSA30-353-5days 霍乱沙门氏菌TSBTSA30-353-5days 金黄色葡萄球菌TSBTSA30-353-5days 表格 3. 固体培养基促生长能力测试结果培养基测试菌株测试次数平均菌落数回收率 (%) 接种量回收量TSA 黑曲霉1 19 17 87 2 19 16 86 3 92 81 89 枯草芽孢杆菌1 135 114 85 2 85 82 96 3 128 120 84 白色念珠菌1 52 50 95 2 64 51 79 3 77 57 73 铜绿假单胞菌1 89 56 63 2 3