实验一 蛋白质含量测定方法的研究

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1、生物化学实验预习报告生物化学实验预习报告实验一实验一 蛋白质含量测定方法的研究蛋白质含量测定方法的研究一、研究背景一、研究背景 蛋白质含量的测定广泛应用于生产实践、医药卫生等各个领域，如测定牛奶等食品中 蛋白质的含量作为其营养成分的参考值，测定病人尿液中蛋白质的含量以检测其是否患有 某种疾病等，因而测定蛋白质的含量具有非常重要的意义。由于蛋白质本身具有一系列的 特点（如具有等电点、富含有机氮、含有肽键、存在某些含共轭双键的氨基酸残基、可与 某些染料结合等） ，利用它的这些特点可以通过特定的化学反应或者某些物理手段，将一定 量的蛋白质转化为可以方便定量测定的其他量，从而达到测定蛋白质含量的目的。

2、蛋白质 诸多特点的存在决定了它会有不同的测定方法，同时由于多种非蛋白组分的存在和干扰以 及各种方法本身的局限性（适用条件） ，每一种测定方法都有各自的优缺点，某一种方法并 不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，所以多种测定方法的共存是有意义的。目前 常用的蛋白质含量测定方法有四种：凯氏定氮法、Folin-酚法、考马斯亮蓝（G-250）法、 紫外法，其中后三种方法最常用。在实际工作中，需要根据所测定对象的具体情况综合考 虑各种因素(如实验器材的限制、实验所要求的灵敏度和精确度、所测定蛋白质的种类与性 质、溶液中存在的干扰物质、测定所花费的时间等)，有选择性地使用某种方法。 二、研究目标二、研究

3、目标 1.掌握常用的蛋白质含量测定方法的原理和操作流程；（基础目标） 2.了解不同测定方法的优点和局限性，掌握在实际工作中不同测定方法的选择条件； （基础目标） 3.证明非蛋白组分在蛋白质含量测定中存在干扰，并通过分析实验结果确定该干扰在 实际工作中是否可以忽略。 （高级目标） 三、研究策略三、研究策略 本实验最重要的目的是为了确定非蛋白组分在蛋白质含量测定中存在的干扰是否可以 忽略。思路有两种：一种方法是先测定纯蛋白质溶液中蛋白质含量，随后在该溶液中加入 非蛋白组分（如嘌呤、嘧啶等吸光物质，Ca2+等金属离子，无机酸或无机碱，甚至某些色 素等） ，测定此时蛋白质含量，对比两次测定结果，计算相

4、对误差，从而得出非蛋白组分的 影响程度；另一种方法是直接使用天然的蛋白质粗提取物（含有非蛋白组分，并将其中包 含的所有非蛋白组分看成一个影响因素） ，来测定粗提取物中的蛋白质含量。考虑到第一种 方法中涉及到的非蛋白组分的加入量没有标准，这些非蛋白材料（影响因素）实验室内也 不一定有，更重要的是该实验所具有的实际意义不大，故决定采用第二种方案。但是方案 二所存在的一个问题是所测组分蛋白质含量的真实值未知，测得的结果没有可以参考比较 的依据，所以需要另外找一个可以参考的标准。 所采取的策略是先用不同的方法测定已知标准蛋白质溶液的浓度，三个测定值之间会 有一定的相关性（或者说测定值之间的变化符合某种

5、趋势） ，随后测定天然样品蛋白质粗提 取液中蛋白含量，得到另外三个测定值，这三个测定值之间同样会存在一定的相关性。如 果这两个相关性关系（或者说变化趋势）大致相同，则认为非蛋白组分的影响很小，可以 忽略，相反则不能忽略。具体分以下五步走： 1.分别用紫外法、Folin-酚法、考马斯亮蓝（G-250）法对标准牛血清白蛋白溶液绘制 标准曲线；2.结合各标准曲线，用三种方法分别测定待测样液 1（待测液 1A，500g/ml BSA、待 测液 1B，250g/ml BSA、待测液 1C，100g/ml BSA、待测液 1D，10g/ml BSA）各组中 蛋白质的含量； 3.用三种方法分别测定待测样液

6、2（生物样品的蛋白质粗提取液，含非蛋白组分）的 蛋白质含量； 4.对比分析在不同稀释倍数下使用各种方法测定的样液 1 中各组蛋白质的含量值，与 真实值相比较并计算相对误差，得出不同测定方法的精确度或者所适宜测定的蛋白质浓度 范围； 5.将不同方法测定的样液 1 及样液 2 蛋白质含量值分别绘制成曲线图，对比分析两条 曲线的波动趋势或相似程度，若波动趋势大致相同，则说明非蛋白组分在蛋白质含量测定 中的影响可以忽略；若波动趋势明显相差较大，则非蛋白组分在蛋白质含量测定中的影响 不能忽略。 四、研究方案及可行性分析四、研究方案及可行性分析 1.实验原理与技术实验原理与技术 （1）凯氏定氮法 原理：样

7、品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产 生氨，氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸溶液吸收，再 用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。总体上分为样品消化、蒸馏、吸收和 滴定四个过程。 优点：是一种蛋白质的经典测定方法，适用广泛，可用于动植物各种组织、器官及食 品等组成复杂的样品测定；测定结果准确，重现性好，往往将该方法测定的蛋白质作为其 他方法的标准蛋白，该方法也是目前分析有机化合物含氮量最常用的方法。 缺点：灵敏度低，0.21.0mg/ml；蒸馏与吸收操作装置较复杂，不便于操作；实验过 程所需时间较长，操作费时；因实验过程会产生有

8、毒气体，通常需在通风橱中进行样品消 化，另外样品与浓 H2 SO4 共热，有一定危险。 基于上述操作的不便性及危险性，本次实验不使用该方法测定蛋白质含量。 （2）紫外法 原理：在蛋白质分子中，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋 白质具有吸收紫外光的性质，且吸收峰在 280nm 处，在该波长范围内，其吸光度（即光密 度值 OD280）与蛋白质含量（浓度）呈正比关系，故可进行蛋白质含量的测定。 优点：简便、灵敏、快速，50100g/ml；低浓度盐类不干扰测定；不消耗样品，测 定后样品仍能回收使用。 缺点：准确度较差，干扰物质多。在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准 蛋白质

9、中酪氨酸、色氨酸含量差异较大的蛋白质有一定的误差，故该方法适用于测定与标 准蛋白氨基酸组成相似的蛋白质；若样品中含有嘌呤、嘧啶以及核酸等吸收紫外光的物质 时，会出现较大的干扰，需进行矫正，但不同蛋白质及核酸的紫外吸收值不同，虽经过矫 正但还是存在一定的误差；在测定时，由于蛋白质吸收高峰常因 pH 的改变而有变化，因 此需要注意溶液的 pH，且测定样品时 pH 要与测定标准曲线时相一致；该方法适于测无色 样品，对有色样品需进行预处理，排出颜色干扰之后才能使用此方法。1 （3）Folin-酚法（Lowry 法） 原理：该方法根据蛋白质侧链基团中的特殊残基进行含量测定，其基础是蛋白质中所 含的酪氨酸

10、、色氨酸等残基数目与蛋白质含量成正比。首先由 Folin-酚试剂甲（相当于双 缩脲试剂）中的 Cu+离子在碱性条件（pH10）下与蛋白质中的肽键形成络合物，然后加入 试剂乙（磷钨酸和磷钼酸的混合液）使其被蛋白质中的含有酚基的氨基酸残基还原为钼蓝和钨蓝的混合物，呈现出蓝色反应。反应颜色的深浅与蛋白质含量呈正比，据此可测定蛋 白质的含量。 优点：反应灵敏，10200g/ml，灵敏度为紫外法的 1020 倍，为双缩脲反应的 100 倍；操作简便，适于小规模分析。 缺点：稍微有些费时，且需要严格控制时间；显色量随蛋白质种类的不同而有差异； 与蛋白质的反应为非特异性反应，抗干扰能力较差，如 Mg2+、T

11、ris 缓冲液、甘油、EDTA 等均会产生干扰。 （4）考马斯亮蓝（G-250）法（Bradfold 法） 原理：根据蛋白质与染料相结合的原理而设计。在酸性溶液中，考马斯亮蓝 G-250 染 料与蛋白质相结合，使染料的最大吸收峰的位置由 465nm 变为 595nm，溶液的颜色也由 棕黑色变为蓝色。有研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和 芳香族氨基酸残基相结合。在波长为 595nm 下的吸光度值 A595与蛋白质浓度呈正比，故 可用于蛋白质的定量测量。 优点：是目前灵敏度最高的蛋白质含量测定方法，可精确测量到 1g/ml；测定快速简 便，只需要一种试剂，蛋白质与染料结合

12、 2min 左右就可达到平衡，且结合物在 1h 内保持 稳定；干扰物质少，干扰 Lowry 法的 K+ 、Na + 、Mg2+离子、Tris 缓冲液、蔗糖、甘油、 巯基乙醇、EDTA 等均不干扰该测定方法。故该方法适用于灵敏度要求高、快速定量测定 微量蛋白质的测定。2 缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradfold 法用于 不同蛋白质测定时会有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g-球蛋白为标准蛋白质以 减少该方面的误差；仍存在一些物质干扰此方法的测定，如去污剂、Triton X-100、十二烷 基硫酸钠（SDS）和 0. 1N 的 NaOH 等；标准曲线也有

13、轻微的非线性（尤其是在溶液浓度较 高时） ，故不能用朗伯-比尔定律进行计算而只能用标准曲线来确定未知蛋白质的浓度。 2.实验可行性分析实验可行性分析 就实验方案而言，本实验首先通过对不同浓度标准蛋白溶液的测定与误差分析来确定 不同测定方法的灵敏度及准确性，然后测定生物的未知蛋白粗提取物中蛋白质含量，分别 做出不同方法所得到测定值的两个波动趋势，分析他们之间是否具有相似性，从而得出非 蛋白组分的影响在蛋白质含量测定中是否可以忽略。方案合理，简便易行，具有可行性。 另外，实验中所要用到的材料、试剂、仪器在生物化学实验室中均可方便获得，故就实验 器具而言也具有可行性。下文中会通过具体实验流程计算该实

14、验大概所需时间为 5h，时间 上也具有可行性。综合以上各点，该设计实验具有可操作性。 3.预期的实验结果预期的实验结果 （1）高浓度时紫外法测定的蛋白质含量最接近真实值，低浓度时考马斯亮蓝（G- 250）法测定的蛋白质含量最接近真实值； （2）非蛋白组分在蛋白质含量测定中确实存在着影响，且该影响在实际测定过程中 不能够忽略。 五、具体实验设计五、具体实验设计 1.主要实验材料、试剂及仪器主要实验材料、试剂及仪器 紫外分光光度计（ ） 、722 型分光光度计（ ） 、分析天平（ ） 、移液管（ ） 、试管（ ） 、具塞刻度试管（ ） 、50ml 容量瓶（ ） 、100ml 容量瓶（ ） 、研钵（

15、 ） 、乙醇（ ） 、标准牛血清白蛋白溶液 （1mg/ml BSA，250g/ml BSA，100g/ml BSA） 、待测样液 1（待测液 1A，500g/ml BSA、待测液 1B，250g/ml BSA、待测液 1C，100g/ml BSA、待测液 1D，10g/ml BSA） 、待测样液 2（生物样品的蛋白质粗提取液） 、Folin-酚试剂甲、Folin-酚试剂乙、考马 斯亮蓝 G-250。 2.操作步骤操作步骤 2.1 紫外法测定蛋白质含量 实验流程图： 牛血清白蛋白标准溶液（1 mg/ml）的配制（配方见附录 1）牛血清白蛋白标准溶液（1 mg/ml）与蒸馏水混合得到 0-1 mg

16、/ml 蛋白质溶液0-1 mg/ml 蛋白质溶液光密度值 OD280的测定（用光程 1cm 的石英比色杯）绘制 0-1 mg/ml 标准曲线待测液 1（四组 1A、1B、1C、1D）OD280的测定（每组测 3 次取平均值）待测液 2 OD280的测定（测 3 次取平均值）蛋白质含量的计算 原始数据记录处： 表表 1 0-1 mg/ml 蛋白质溶液 OD280值管号123456781 mg/ml 标准蛋白 质液 （ml）00.51.01.52.02.53.04.0dH2O（ml ）43.53.02.52.01.51.00蛋白质浓 度 （mg/ml）00.1250.250.3750.500.6250.751.0OD280表表 2 待测液 1 的 OD28