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1、治疗用单链寡核苷酸药物的非临床研究评价治疗用单链寡核苷酸药物的非临床研究评价概述概述余珊珊、胡晓敏、王海学、王旸、王庆利（国家食品药品监督管理总局药品审评中心，北京 100038）摘要摘要 单链寡核苷酸（Single-stranded oligonucleotide, SSO）是一种人工 合成寡核苷酸，可按碱基互补配对原则主要通过与靶 RNA 杂交，诱导断裂、调节剪切、 抑制翻译等作用抑制靶 RNA 功能，在基因层面具有潜在的治疗作用。但未经修饰的 SSO 易被核酸酶降解，经化学修饰的 SSO（如经锁核酸修饰后的 SSO）其稳定性、杂交亲和力 和酶切效率大大提高，成药性显著增强。目前，已有 4
2、 个治疗用 SSO 药物在美国或欧洲 上市，更多的候选药物处于研发阶段。本文将从上市监管、非临床特点、非临床安全性 试验一般原则等方面阐述治疗用 SSO 药物的非临床研究评价要点。关键词关键词 治疗用单链寡核苷酸药物，锁核酸，非临床研究评价一、概述一、概述1 1、单链寡核苷酸和锁核酸、单链寡核苷酸和锁核酸治疗用寡核苷酸类药物是当今快速发展的药物研发领域，按治疗机制可分为反义 寡核苷酸(ASO，Antisense oligonuclitide)、核酶(ribozyme)/脱氧核酶 (DNAzyme、deoxyribzyme)、小干扰 RNA（Small interfering RNA，siRNA
3、）、microRNA 等等96。 单链寡核苷酸（Single-stranded oligonucleotide, SSO）是人工合成寡核苷酸， 长度通常 1225 个单位，分子量在 50007000D 范围内，按碱基互补配对原则与细胞内核 酸(主要是 RNA)杂交，通过诱导靶 RNA 降解、抑制翻译、调节剪切等作用调节内源性 mRNA 的功能，使靶 RNA 功能丧失。单链寡核苷酸与双链的 siRNA 在理化性质方面有较大 差异。未经修饰的单链寡核苷酸易被核酸酶降解，缺乏酶活性, 不能破坏靶基因, 仅起 到基因封条的作用，不具备成药性。于是人们采用化学修饰方法改善其稳定性。如采用 硫原子取代磷酸
4、骨架上的非成键氧原子，或对寡核苷酸进行糖修饰，使成药性显著提高。锁核酸（LNA，Locked Nucleic Acid）是经化学修饰后得到的一种特殊的双环状 核苷酸衍生物, 是含有一个或多个 2-O , 4-C-亚甲基-D-呋喃核糖的核酸单体, 其核糖的 2-O 和 4-C 位通过缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥， 并连接成环形。这个环形桥锁定了呋喃糖 C3-内的 N 结构，降低了磷酸盐骨架局部结构 的柔韧性, 增强了稳定性。LNA 和 DNA/RNA 有相同的磷酸盐骨架,其寡核苷酸链可用 DNA 自动合成仪合成，通过糖环上携带不同的碱基，得到不同的 LNA 单体。LNA 具有杂
5、交亲和力高、反义活性、抗核酸酶以及水溶性好和毒性相对较低的特 点。LNA 修饰 DNAzyme 是具有核酶切除 RNA 能力的反义寡核苷酸，10-23 DNAzyme 含有一 个保守催化区和两个可变侧翼结合区，当侧翼结合区特异地与靶 RNA 结合后，催化区在 两个结合臂之间酶解消化磷酸二酯键。通过在 DNAzyme 的两个结合臂上引入一个或几个 LNA 单体，可增加其与底物的杂交亲和力, 使酶切效率明显提高。单链寡核苷酸和锁核酸由于具备了以上生物学特性，因而具有在基因水平产生药 理作用的潜能。目前已有 4 个单链寡核苷酸药物批准上市，更多处于研发阶段。本文将 从的上市监管、非临床特点、非临床安
6、全性试验一般原则等方面阐述单链寡核苷酸药物 的非临床研究评价要点。2 2、上市药物情况、上市药物情况目前，已有 4 个单链寡核苷酸药物在美国或欧洲批准上市。FDA 于 1998 年批准第一个反义药物-福米韦生 (fomivirsen)上市。福米韦生由 21 个硫代脱氧核苷酸组成，通过对人类巨细胞病毒(CMV) mRNA 的转录抑制发挥特异性的 抗病毒作用, 玻璃体内注射用于治疗艾滋病并发 CMV 视网膜炎。常见不良反应有眼内压 升高和轻中度前后房炎症反应，未见明显全身毒性。出于商业考虑，该药于 2002 年和 2006 年先后在欧盟和美国撤市，主要原因可能是市场过于狭小。第二代寡核苷酸药物米泊
7、美生(mipomersen)由法国赛诺菲旗下的健赞公司开发， 用于治疗遗传性胆固醇代谢紊乱。于 2013 年 1 月由 FDA 批准上市，商品名 Kynamro，在 欧洲未获得上市批准1。米泊美生为每周 1 次，皮下注射给药，单药或与其他降脂药物 合用，用于治疗罕病纯合子家族性高胆固醇血症( HoFH) 。米泊美生是硫代磷酸寡核苷 酸钠盐，通过与编码载脂蛋白 B-100 的 mRNA 杂交导致其降解，从而抑制载脂蛋白 B-100 在肝脏的转录合成。米泊美生的主要毒性是肝毒性，可引起 ALT、AST 升高和肝脏脂肪变 性，FDA 说明书提出了严重肝毒性的黑框警告。米泊美生还可能引起流感样症状、注
8、射部 位刺激性等不良反应。2016 年 9 月，FDA 在临床药效证据不充分的情况下，加速批准了 SAREPTA THERAPS 公司的 eteplirsen 有条件上市，该药静脉注射治疗杜氏进行性肌营养不良症 （Duchenne Muscular Dystrophy，DMD），通过结合肌营养不良蛋白(dystrophin)基因 外显子 51 的前体 mRNA（pre-mRNA），诱导患者突变的 exon 跳跃。另一个用于 DMD 治疗 的 Drisapersen 由 GSK 和 Prosensa 研发。在 III 期临床试验（DMD114044）中， Drisapersen 组和安慰剂组的主
9、要药效终点指标（6 分钟步行距离）和其他次要终点指标 未见显着差异，由于药效未达预期而终止开发。其临床常见不良反应主要包括注射局部 刺激性和肾功能损伤。2016 年 12 月，FDA 批准 Biogen IDEC 公司的 Nusinersen（Spinraza）上市，鞘 内注射治疗罕见遗传病-儿童和成人的脊髓性肌萎缩（SMA）。SMA 患者染色体 5q 臂上的 基因突变，导致运动神经元生存（Survival of motor neuron，SMN）蛋白缺失。 nusinersen 可结合 SMN 转录外显子 7 下游内含子中的一段特定序列，增加 SMN2 基因 mRNA 转录包涵的外显子 7，
10、增加完整长度 SMN 蛋白的表达。3 3、监管和技术指导原则、监管和技术指导原则单链寡核苷酸是化学合成药物，虽然具备生物制品的属性，但按新化学实体进行 监管。目前尚无专门针对单链寡核苷酸药物研究的技术指南。ICH S6 指导原则适用对象 是生物制品，但同时“可能也适用于寡核苷酸类药物”2。迄今唯一的专门论述反义寡 核苷酸监管的文件是 CHMP 2005 年发表的有关其遗传毒性潜在作用评估的回顾报告3， 该报告指出硫代磷酸寡核苷酸及其降解代谢物通过掺入新合成 DNA 造成遗传毒性的可能 性小，但理论上存在通过形成 DNA 三股螺旋诱导基因突变的可能性。二、非临床特征二、非临床特征1 1、药学特点
11、简述、药学特点简述单链寡核苷酸是带有多个负电荷的水溶性物质，极性较大，通常采用固相合成制 备。单个核苷酸通过 5和 3两个羟基与磷酸二酯连接，将单个核苷酸选择性地脱去 5上保护基团后与原寡链相连接，然后脱去 3上羟基，磷酸酯化后与下一个核苷酸连接。 如此循环合成至所需长度，再从固相上切除纯化。单链寡核苷酸的总杂质水平约 5-15%，大多数杂质属于与活性成分密切相关的有 关物质，如缺失 1 个或多 1 个（n-1 或 n+1）的寡核苷酸序列，具有相似的生物活性。由 于极性较大，通常采用离子交换色谱法纯化，但其性质导致其与主峰难以有效分离。单 链寡核苷酸粗品中其他杂质还可能包括四氮唑、三氟醋酸等合
12、成试剂。从临床前至临床阶段，单链寡核苷酸 API 质量控制策略是逐步降低杂质水平，粗品经纯化后核苷酸纯度 可从 80-85%增加至 90-95%。2 2、药效学特点简述、药效学特点简述寡核苷酸调控靶 RNA 功能直至蛋白表达水平的改变具有剂量-浓度-时间依赖性， 药效发生取决于药物从血浆房室分布至胞内靶 mRNA 所需时间及下游信号转导的过程。与 血浆分布相比，单链寡核苷酸分布至胞内所需时间长，其作用机制决定了起效较慢，因 此 PD 应答与药物浓度之间通常有一段滞后。因此对药效终点的观察通常采用效应房室模 型或间接效应。3 3、安全性特点、安全性特点单链寡核苷酸具有适配体（aptamer）特性
13、，可与核酸、多肽、蛋白质等有机分 子发生高亲和力、高特异性的结合，类似抗原-抗体结合反应，其药理作用与生物大分子 更为接近。单链寡核苷酸的多种毒性与其适体作用有关4,5,6。单链寡核苷酸可通过细 胞内吞迅速在肝、肾和网状内皮系统中分布，已知由脱靶杂交引起的毒性主要包括肝肾 毒性、血液毒性和免疫刺激等。（1 1）肝肾毒性）肝肾毒性单链寡核苷酸半衰期长，肝和肾等组织中蓄积明显。当靶组织为肝肾以外组织， 单链寡核苷酸可与非靶部位的细胞膜、溶酶体、胞质或和核蛋白杂交，引起脱靶毒性， 尤其是肝毒性和肾毒性。（2 2）血液系统毒性）血液系统毒性单链寡核苷酸带负电荷，可与血细胞蛋白质上的阳离子部位结合，造成
14、血小板减 少，或通过抑制外源性凝血途径因子 X 酶复合物(Tenase complex) 延长凝血时间。单链 寡核苷酸也可直接激活血液中补体旁路途径的补体因子 H，激活补体系统，造成血液动力 学改变，产生潜在的心血管系统毒性。猴补体因子 H 对单链寡核苷酸的敏感性高于人类 14,15,16 。（3 3） 免疫刺激免疫刺激天然免疫系统通过 Toll 样受体（TLR）等模式识别受体（PRR）识别保守的病原 相关分子（PAMP），激活早期免疫反应。细菌和病毒核酸可活化 PRR，诱导细胞因子生成。 由于寡核苷酸化学修饰的特定序列（例如两侧为 2 个 5“嘌呤和 2 个 3“嘧啶的 CpG 二聚体） 与
15、细菌 DNA 极为相似，可被 PRR 识别，从而活化 B 细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状 细胞，引起杂交非依赖性效应7,8,9,10,11,12,13，促进炎性细胞因子分泌。单链寡核 苷酸对啮齿类动物的免疫毒性主要包括多器官（包括肝）淋巴组织细胞浸润、肝脾重量 增加和淋巴增生；NHP 的常见免疫毒性包括皮下给药局部刺激、淋巴增生、脾重增加、细 胞因子或趋化因子一过性升高。NHP 对 PRR 相关免疫刺激敏感性较低，与临床相关性更好。 啮齿类动物可能过度预测炎症反应 17。此外，由于单链寡核苷酸在靶组织蓄积，其药 理作用放大也可能导致毒性。在研发早期可采用人免疫细胞开展免疫刺激效应全血测定，
16、对单链寡核苷酸的免疫刺激和补体活化相关毒性进行早期常规筛查。4 4、免疫原性、免疫原性单链寡核苷酸具有免疫原性18。目前已检测到针对不同单链寡核苷酸的交叉反 应抗体。在米泊美生临床研究中，3260%的患者体内检出 ADA，但对药效的影响不明确 19。Drisapersen 临床连续 48 周皮下注射给药，29%患者在 36 个月出现 ADA，未观察 到对 PK/PD 和安全性的显著影响20。5 5、药代动力学、药代动力学目前，单链寡核苷酸非临床和临床最灵敏的检测方法为杂交酶联免疫吸附法 （hELISA）21，常用于药物原形的定量检测。LC-MS/MS 也可用于核酸定量测定 22,23 ，灵敏度相对较低，主要用于对分解代谢物如 5“和 3“端 n-1、n-2、n-3 等寡核 苷酸链的鉴定24,25。此类代谢物是否保留药理活性或毒性取决于其序列和相对量。放 射性标记法（如氚标）已也成功用于单链寡核苷酸的组织分布研究25。（1 1）单链寡核苷酸药代动力学总体特征）单链寡核苷酸药
